材料和方法

化學(xué)品

煤油和正十六烷 (99%) 是 Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany) 的產(chǎn)品。 菜籽油購自超市。 原油由 ENI Norge 提供。 苯并 (a) 芘粉末 (>96%) 和苯并 (a) 芘溶液（100 ng/μl 的環(huán)己烷溶液）購自 Sigma Aldrich（美國密蘇里州）。 溶劑甲基叔丁基醚 (MTBE)、庚烷和環(huán)己烷是 Merck KGaA（德國達(dá)姆施塔特）的產(chǎn)品。 除非另有說明，否則所用化學(xué)品均為分析級。

沙子和海水樣品

從沿挪威海岸線（包括朗格松、赫瓦勒、Tj?me、羅弗敦和奧斯陸港）的歷史石油烴污染地點(diǎn)收集的沙子/土壤樣本和海水用于分離烴降解細(xì)菌。

媒體

將微生物維持在 Marine Agar 2216 (Difco) 或 Marine Broth 2216 (Difco) 上。 煤油或其他特定碳源上的細(xì)菌生長在改良的 Bushnell Haas (MBH) 培養(yǎng)基上進(jìn)行，該培養(yǎng)基含有（在 1 升海水中）： KH2PO4，（1 克）； K2HPO4，（1 克）； NH4NO3，（1 克）； MgSO4·7H2O（0.2克）； CaCl2·2H2O（0.02克）； FeCl3·6H2O（0.05 克）。[11]

烴類降解菌的分離

通過 0.2 μm 過濾器無菌過濾 400 ml 的海水。 然后將過濾器放入 250 毫升錐形燒瓶中，該燒瓶中預(yù)裝了 50 毫升 MBH 肉湯。 對于土壤/沙子樣品，使用 5 克土壤/沙子。 根據(jù)污染場地，補(bǔ)充 1% (w/w) 的過濾滅菌柴油或原油作為碳和能源。 然后將接種的燒瓶在 13°C、160 rpm 下培養(yǎng) 3 周，并在相同培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)兩次。 隨后將第三次富集培養(yǎng)物在 MBH 中稀釋到適當(dāng)?shù)南♂尪?，并鋪在海洋瓊?2216 上。這產(chǎn)生了 84 個具有不同形態(tài)的菌落。 選擇不同的菌落并再次在海洋瓊脂 2216 上劃線以獲得純培養(yǎng)物。

篩選表面活性特性

從斯瓦爾巴群島海灘沉積物中分離出的能夠利用煤油作為碳源和能源的挪威漁業(yè)科學(xué)學(xué)院培養(yǎng)物保藏中心的 93 株新的碳?xì)浠衔锝到饩昱c 93 株菌株一起篩選了 SAC 生產(chǎn)能力。 菌株在海洋瓊脂平板上于 13°C 培養(yǎng) 1 周。 隨后將每種分離物的單菌落接種在試管中，加入 3 ml MBH 培養(yǎng)基并補(bǔ)充有 1% (w/w) 葡萄糖或煤油。 將管在 13°C (180 rpm) 下用葡萄糖培養(yǎng) 1 周，用煤油培養(yǎng) 4 周。 通過離心（10,000 rpm 10 分鐘）將細(xì)胞與培養(yǎng)液分離。 對完整培養(yǎng)物和無細(xì)胞上清液進(jìn)行生物表面活性劑和乳化特性的測定，如下所述。

SAC 生產(chǎn)的光學(xué)畸變測定

從每個菌株的培養(yǎng)上清液中取出 100 μl 體積并加入到平底 96 微孔板中。 然后將這些板放在一張帶有黑色網(wǎng)格的紙上并進(jìn)行檢查。 網(wǎng)格的光學(xué)畸變?yōu)?SAC 的存在提供了定性分析。 [12]

用于 SAC 生產(chǎn)的油擴(kuò)散試驗(yàn)

將蒸餾水 (3 ml) 裝入 24 孔微孔板的每個孔中。 將 10 μl 原油加入蒸餾水中，并將約 10 μl 細(xì)菌培養(yǎng)物逐漸加入油層中心。 如果培養(yǎng)物中存在 SAC，則油將被置換并形成清潔區(qū)。 還包括分別使用 10 μl 蒸餾水和 10 μl Tween 80 (0.1% w/w) 的陰性和陽性對照。 [13]

乳化試驗(yàn)

如 Batista 等人所述測量無細(xì)胞上清液的乳化活性。 [14]。 選擇在初始定性篩選中產(chǎn)生穩(wěn)定混濁乳液層的上清液進(jìn)行定量乳化測定，在試管（φ 13 mm × 16 mm）中使用 5 ml 上清液和 5 ml 煤油。 然后將混合物渦旋2分鐘并在室溫下靜置。 24 小時后估計相對乳液體積 (EV %) 與總液體體積。

表面張力和臨界膠束濃度 (CMC) 測量

根據(jù) Du Nouy 方法，使用 EZ-Piplus 張力計（Kibron，芬蘭）測量培養(yǎng)物和培養(yǎng)物上清液的表面張力。 [15] 提取的 SAC（見下文）重新懸浮在蒸餾水中并稀釋到不同的濃度。 測量稀釋液的表面張力以確定CMC。 CMC 是表面張力值達(dá)到最低水平時 SAC 的最低濃度。

生物表面活性劑的生產(chǎn)和提取

SAC 陽性菌株在 50 ml 海洋肉湯中預(yù)培養(yǎng) 24 小時。 然后通過在 5°C 下以 4500 rpm 離心 20 分鐘收獲細(xì)胞，并用 MBH 培養(yǎng)基洗滌 3 次。 將細(xì)胞沉淀重新懸浮在 100 ml MBH 培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有 2% (w/w) 過濾滅菌的煤油、正十六烷或高壓滅菌的菜籽油。 將燒瓶在旋轉(zhuǎn)振蕩器中以 160 rpm 在 20°C 下孵育 7 天。

為了在靜息細(xì)胞條件下生產(chǎn) SAC，將細(xì)菌分離物在 50 ml 海洋肉湯中預(yù)培養(yǎng) 24 小時。 然后通過在 5°C 下以 4500 rpm 離心 20 分鐘收獲培養(yǎng)物，并用含有 K2HPO4 1 g 的磷酸鹽緩沖液洗滌 3 次； KH2PO4 1 g 和 NaCl 19.7 g。 將細(xì)胞沉淀（0.6 g）重新懸浮在補(bǔ)充有 2% (w/w) 過濾滅菌煤油的 50 ml 磷酸鹽緩沖液中，隨后將細(xì)胞懸浮液在 160 rpm 和 20°C 下孵育 5 天。

根據(jù) Kuyukina 等人的方法提取生物表面活性劑。 [16] 稍作修改。 將等體積的 MTBE 添加到培養(yǎng)物中。 將混合物在 45 kHz 下超聲 5 分鐘，隨后在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以 200 rpm、20°C 振蕩 3 小時，然后在 4°C 下以 4500 rpm 離心 5 分鐘以分離兩相。 將頂部溶劑層轉(zhuǎn)移到干凈的燒杯中并在 37°C 下干燥。

16S rRNA基因序列分析

選定的分離株在 16°C 下在海洋肉湯中培養(yǎng) 24 小時。 對于 16S rRNA 基因擴(kuò)增，使用 InstaGene 矩陣試劑盒（Bio-Rad，英國）按照制造商的說明分離細(xì)菌染色體 DNA。 16S rRNA 基因使用 PCR 方法用 1 U Taq DNA 聚合酶 (VWR) 和通用引物 27F (5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 和 1492R (5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT) 進(jìn)行擴(kuò)增。 根據(jù)制造商的方案，使用 BigDye 終止子試劑盒 3.1 版（Applied Biosystems）對 16S rRNA 基因進(jìn)行測序，使用通用引物 515F（5' -GTGCCAGCAGCCGCGGTAA）。 PCR 測序后，使用 Applied Biosystems 3130xl 基因分析儀對樣品進(jìn)行測序。 使用 RDP (http://rdp.cme.msu.edu) 提供的 SEQMATCH 程序進(jìn)行分類學(xué)分類。 使用國家生物技術(shù)信息中心 (NCBI) 的 BLAST 2.2.12 版檢查序列同源性。 16S rRNA 基因序列以登錄號提交給 GenBank。

正十六烷的生物降解

來自紅球菌屬的生物表面活性劑。 研究了菌株 LF-22 對正十六烷生物降解的影響。 將過濾除菌的正十六烷 (1 ml) 添加到 100 ml 高壓滅菌的海水中，并補(bǔ)充有 KH2PO4 (1 gl-1)； K2HPO4 (1 gl-1 ); NH4NO3 (1 gl-1 ) 和 FeCl3·6H2O (0.05 gl-1 )。 將提取的生物表面活性劑以終濃度為 CMC 的兩倍添加到燒瓶中。 Yarrowia spp. 的混合酵母培養(yǎng)物 LS-DO。 作為正十六烷降解劑接種在燒瓶中。 LS-DO 能夠利用正十六烷和煤油作為唯一的碳源和能源。 樣品 1 是僅包含正十六烷的對照（表 4）。 樣品 2 含有正十六烷和生物表面活性劑。 樣品 3 補(bǔ)充有正十六烷和耶氏酵母屬。 LS-DO。 樣品 4 與樣品 3 相似，但添加了生物表面活性劑。 將燒瓶在 180 rpm、13°C 下孵育 17 天。 在開始和 13 天和 17 天后測量培養(yǎng)物在 600 nm 處的光密度、表面張力和培養(yǎng)物的正十六烷濃度。 使用分配重量法測量培養(yǎng)物中正十六烷的濃度。 [17]

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