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芬蘭Kibron專注表面張力儀測(cè)量技術(shù),快速精準(zhǔn)測(cè)量動(dòng)靜態(tài)表面張力

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酯功能化的雙子表面活性劑與血紅蛋白的結(jié)合——材料和方法

來源:上海謂載 瀏覽 1219 次 發(fā)布時(shí)間:2021-11-15

2、材料和方法


2.1. 材料


人血紅蛋白 (Hb) 購(gòu)自 Sigma-Aldrich 并按原樣使用。 雙子表面活性劑 乙烷-1, 2-diyl bis (N, N-二甲基-N-十六烷基乙酰氧基)二氯化物[16- E2-16]如[40]中所述合成,其結(jié)構(gòu)為 如方案 1 所示。整個(gè)過程中都使用了 Millipore 水 實(shí)驗(yàn)。 Hb (5 μM) 的儲(chǔ)備溶液在 100 mL 10 mM 磷酸鈉緩沖液 (pH 7.4) 而 16-E2-16 的儲(chǔ)備溶液在水中制備。 使用分光光度法測(cè)定 Hb 的濃度 280 nm 處的消光系數(shù) 118872 M-1 cm-1。


2.2. 方法


2.2.1. 表面張力分析


表面張力由 Delta-Pi Langmuir 測(cè)量 微張力計(jì)(Kibron,赫爾辛基,芬蘭)基于桿上的最大拉力(Du Nouy-Padday)并利用小直徑 (0.51 mm) 特殊合金線。 通過滴定法將16-E2-16加入到Hb溶液中。 樣品的值是在 298.15 K、308.15K 和 318.15K。


測(cè)量池的溫度由以下控制: Grant GD120 水溫控器。 每次溫度測(cè)量后,將合金線清洗并在酒精中干燥 火焰。


2.2.2. 吸光度測(cè)量


吸收光譜在配備珀耳帖型溫度控制器的 Jasco-660 分光光度計(jì)中測(cè)量 (ETCS761)。 使用的蛋白質(zhì)濃度為 5 μM,用于光譜 700–300 cm?1 范圍內(nèi)的測(cè)量值。 使用光程長(zhǎng)度為 1.0 cm 的池。 將 2000 μL 的 5 μM 蛋白溶液放入 放入 1.0 cm 比色皿中,并用 20 μM 儲(chǔ)備溶液滴定 16-E2-16。 每次滴定加入 40 μL,譜圖為 記錄?;€校正總是針對(duì)空白進(jìn)行。


2.2.3. 熒光光譜測(cè)量


Trp熒光光譜和同步熒光光譜 在 Jasco 熒光分光光度計(jì)(FP-6200 型)中使用 3 mm 石英池在 25 ± 0.1 °C 下測(cè)量天然條件下的 Hb。 這 電池的溫度通過來自外部恒溫水浴的循環(huán)水來維持。 使用的蛋白質(zhì)濃度 為 5 μM。 激發(fā)波長(zhǎng)為 280 nm,發(fā)射光譜記錄在 300-400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)。 由緩沖液和表面活性劑組成的參考樣品 檢查熒光信號(hào)。 2000 μL 操作溶液 通過連續(xù)添加 40 μL 16-E2-16 (20 μM) 儲(chǔ)備溶液來滴定 5 μM Hb。 滴定是通過使用手動(dòng)完成的 一個(gè)微量移液器。 同步熒光光譜的波長(zhǎng)間隔 (αl) 為酪氨酸殘基 (Tyr) 為 20 nm 和 80 nm 分別為色氨酸殘基 (Trp)。


2.2.4. 圓二色性測(cè)量


CD 光譜記錄在 Jasco-715 分光偏振計(jì)上, 配備微型計(jì)算機(jī)。 儀器已校準(zhǔn) (+)-10-樟腦磺酸。 所有 CD 測(cè)量值均為 使用恒溫控制的細(xì)胞架在 298K 下進(jìn)行 連接到 Neslab RTE-110 水浴,精度為 ±0.1K。 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化是 使用 1 mm 路徑在遠(yuǎn)紫外區(qū)域 (200–250 nm) 進(jìn)行監(jiān)測(cè) 長(zhǎng)單元格。 來自含有緩沖液的參考樣品的信號(hào) 并且從所有的 CD 信號(hào)中減去去污劑 測(cè)量。 CD 儀器定期用 D- 10-樟腦磺酸。 為了提高信噪比,在 每次掃描至少進(jìn)行六次累積。 CD 數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換為濃度無關(guān)參數(shù),平均殘留量 橢圓度 [β] (deg cm2 dmol?1),使用關(guān)系式 [43]



其中 θλ 是在波長(zhǎng)處觀察到的橢圓度(以毫度為單位) λ,M0 是蛋白質(zhì)的平均殘基重量,c 是蛋白質(zhì) 以克/立方厘米為單位的濃度,l 是細(xì)胞的光程長(zhǎng)度,以厘米為單位。 222 nm 處的橢圓度值 (θ222nm/mdeg)用于計(jì)算BSA的α-螺旋含量 使用 Morrisett 等人給出的以下等式。 [44]



2.2.5. 分子對(duì)接


進(jìn)行分子對(duì)接以確定蛋白質(zhì) Gemini 表面活性劑結(jié)合親和力、結(jié)合常數(shù)以及 識(shí)別潛在的結(jié)合位點(diǎn)和相鄰的相互作用 Hb 和 16-E2-16 之間。 血紅蛋白的晶體結(jié)構(gòu) (PDB ID: 2D60) 來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。 16-E2-16的結(jié)構(gòu)由ChemDraw Ultra 8.0構(gòu)建。 這 使用分子對(duì)接軟件 AutoDock Vina [45] 進(jìn)行對(duì)接實(shí)驗(yàn)。 盲對(duì)接是由 沿 x、y、z 軸將網(wǎng)格大小設(shè)置為 58、50、54,網(wǎng)格間距為 1000?。 網(wǎng)格中心設(shè)置為 15.499?、3.439?、14.787?。 如 AutoDock Vina 中所述使用默認(rèn)參數(shù) 手動(dòng)的。 總共進(jìn)行了 10 次運(yùn)行,然后 根據(jù)排名選擇最低能量構(gòu)象異構(gòu)體 得分。 分子對(duì)接結(jié)果由 PyMOL [46] 呈現(xiàn)。


2.2.6. 分子動(dòng)力學(xué)模擬


GROMACS 5.0 軟件 [47,48] 用于進(jìn)行 MD 對(duì)未結(jié)合和 16-E2-16 有界 Hb 的模擬。 建立 Hb 分子的電位,GROMOS96 43a1 力場(chǎng) [49,50] 被應(yīng)用。 16-E2-16的最低能量對(duì)接構(gòu)象 用于MD模擬,內(nèi)置拓?fù)鋮?shù) ProGrg 服務(wù)器 [51]。 未結(jié)合和 C16 結(jié)合的 Hb 被溶劑化 SPC 水模型 [52] 在十二面體盒中,包含 7174 和 6587 個(gè)分子。 添加單個(gè)鈉離子 在兩個(gè)系統(tǒng)中以中和整個(gè)系統(tǒng)。 那么能量為 兩個(gè)系統(tǒng)都使用 800 步最速下降進(jìn)行了最小化 算法后跟水箱中的共軛梯度法,用于釋放沖突接觸。 應(yīng)用了兩個(gè)最小化系統(tǒng) 在 300K 時(shí)達(dá)到 100 ps 的位置限制動(dòng)態(tài),其中 Hb 和 Hb-(16-E2-16)復(fù)合物通過添加抑制保持固定 然而,水分子被允許運(yùn)動(dòng)。 最后一步,兩個(gè)系統(tǒng)的 MD 模擬在 300K、1 bar 和 0.1 ps 下的等溫-等壓合奏使用 貝倫森方法。 LINCS [53] 算法用于約束鍵長(zhǎng),允許使用 2 fs 時(shí)間步長(zhǎng)。 范德 瓦爾斯和庫(kù)侖相互作用在 1.2 nm 處被截?cái)唷?MD模擬的所有分析都是使用軌跡分析工具進(jìn)行的 GROMACS 軟件包。


酯功能化的雙子表面活性劑與血紅蛋白的結(jié)合——摘要、簡(jiǎn)介

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