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海洋細(xì)菌中生物表面活性物質(zhì)——結(jié)果和討論
來源:上海謂載 瀏覽 1146 次 發(fā)布時間:2021-10-19
結(jié)果和討論
篩選 SAC 生產(chǎn)商
SAC 生產(chǎn)的篩選包括 84 種新的烴降解分離株和 93 株來自挪威漁業(yè)科學(xué)學(xué)院 (NCFS) 的培養(yǎng)物保藏中心。 所有分離株均在補(bǔ)充有 1% 葡萄糖或煤油作為唯一碳源的 MBH 培養(yǎng)基中篩選。 在測試的所有分離株中,100 個分離株在至少一項定性篩選試驗(光學(xué)變形、油擴(kuò)散或乳化試驗)中顯示出陽性結(jié)果。
對于 SAC 生產(chǎn)的定量評估,確定了表面張力和乳化活性。 良好的生物表面活性劑應(yīng)能夠?qū)⑺蚺囵B(yǎng)基的表面張力降低 ≥20 mN m-1 [13] 或 ≥40 mN m-1。[18] 良好的生物乳化劑的 EV24 值應(yīng)高于 50%。 19] 在 100 個陽性分離株中,只有 4 個菌株能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基的表面張力從 72 mN m-1 的未接種培養(yǎng)基降低至少 20 mN m-1(表 1)。 沒有一株分離株的 EV24 值高于 50%,但其中 18 株的 EV24 值≥19%(表 1)。 我們研究中的培養(yǎng)溫度為 13°C,低于之前研究中使用的溫度(28°C),[14,20] 可能影響了受試菌株的乳化活性。 因此,在 13°C 下 EV24 值≥20% 的分離株在 20°C 下培養(yǎng)。 結(jié)果證實,較低的生長溫度導(dǎo)致測試培養(yǎng)物的較低乳化活性。 11 個分離株中有 10 個在 20°C 下顯示出 EV24 >40%(表 1)。
表 1. 在葡萄糖和煤油上生長的細(xì)菌菌株的培養(yǎng)物和培養(yǎng)物濾液的表面張力和乳化值。
16S rRNA基因測序分析
通過 16S rRNA 基因序列分析對具有顯著 SAC 活性的 18 個分離株進(jìn)行分類鑒定(表 2)。 紅球菌除外。 菌株 LF-13 和紅球菌屬。 在菌株 LF-22 中,大多數(shù)鑒定的 SAC 生產(chǎn)者是革蘭氏陰性菌,屬于 γ-變形菌綱。 也有報道稱 γ-變形菌在寒冷海洋地區(qū)的石油污染地點占優(yōu)勢。 [21-24] 先前對石油污染地點的研究表明,假單胞菌、假交替單胞菌、冰川、海藻和紅球菌是極地、海洋區(qū)域。[21,22,25-28]
表 2. 選定的 SAC 產(chǎn)生的分類從屬關(guān)系 基于 16S rRNA 基因測序的細(xì)菌。
已對假單胞菌屬的代表產(chǎn)生鼠李糖脂 [29,30] 和脂肽 [31-33] 和其他高分子量生物乳化劑的能力進(jìn)行了深入研究。 [34,35] 紅球菌屬以其產(chǎn)生鼠李糖脂的能力而聞名。 [36-38] 具有 SAC 活性的胞外多糖 (EPS) 已被證明是由從海洋環(huán)境中分離出來的假交替單胞菌屬的幾個成員分泌的。[39-42] 耐冷假交替單胞菌屬。 從海冰樣品中分離出的菌株 CAM025 在 -2 和 10°C 下的 EPS 產(chǎn)量是 20°C 下的 30 倍。 [41] 松山等人。 [43] 描述了兩種菌株 Glaciecola chathamensis 的 S18K6T 和 S18K5 菌株產(chǎn)生 EPS 的能力。 據(jù)我們所知,迄今為止,尚未確定 Psychromonas 和 Marinomonas 屬的成員能夠產(chǎn)生 SAC。 因此,目前的分離株是產(chǎn)生 SAC 的分類群列表的補(bǔ)充。
生物表面活性劑生產(chǎn)
基質(zhì)
兩種細(xì)菌菌株紅球菌屬。 菌株 LF-13 和紅球菌屬。 當(dāng)以煤油作為唯一碳源和能源時,菌株 LF-22 能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基的表面張力降低約 40 mN m-1。 因此,它們被選擇用于進(jìn)一步表征生物表面活性劑的生產(chǎn)。 為了拓寬生物表面活性劑生產(chǎn)的底物范圍,測試了除煤油和葡萄糖之外的其他碳源(表 3)。 這兩種菌株可以在葡萄糖上生長,但不合成生物表面活性劑。 他們能夠在正十六烷和菜籽油上產(chǎn)生 SAC,即使菜籽油不支持菌株 LF-22 的生長。
表 3. 所選培養(yǎng)物中的生長和表面張力 不同碳源上的細(xì)菌分離物 (1% w/w)。
生長細(xì)胞的生物表面活性劑生產(chǎn)
菌株紅球菌屬。 菌株 LF-13 和紅球菌屬。 大約 2 天后,菌株 LF-22 達(dá)到穩(wěn)定期(圖 1)。 LF-13 和 LF-22 的培養(yǎng)物表面張力的最低值分別為 31.8 和 29.3 mN m-1,當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到穩(wěn)定期時(圖 1)。 無細(xì)胞制劑的值顯示出與培養(yǎng)物類似的降低,表明生物表面活性劑被釋放到培養(yǎng)基中。 從工業(yè)角度來看,將生物表面活性劑分泌到培養(yǎng)基中的分離物很有趣,因為這使得生物表面活性劑的純化過程更簡單。 [16,44,45]
圖 1. (A) 紅球菌屬的生長曲線和表面張力降低曲線。 菌株LF-13; (B) 紅球菌屬。 菌株LF-22; 在以 2% 煤油為碳源的 MBH 中培養(yǎng),20°C,160 rpm。 結(jié)果代表三個獨立實驗的平均值。
靜息細(xì)胞產(chǎn)生生物表面活性劑
為了確定生物表面活性劑的合成是否與石油烴上的細(xì)菌生長有關(guān),在磷酸鹽緩沖液和煤油中對兩種菌株 LF-13 和 LF-22 進(jìn)行了靜息細(xì)胞實驗。 紅球菌屬的細(xì)胞懸液和無細(xì)胞培養(yǎng)濾液的表面張力。 LF-13 和紅球菌屬。 LF-22 靜息細(xì)胞在培養(yǎng) 2 天后顯示出顯著減少,從 72 到 26 mN m-1(圖 2)。 結(jié)果表明,紅球菌菌株中的生物表面活性劑合成發(fā)生在煤油存在下,但不一定與煤油上的細(xì)菌生長有關(guān)。
圖 2. (A) 紅球菌屬的表面張力降低。 菌株LF-13; (B):紅球菌屬。 LF-22 菌株,在靜息細(xì)胞條件下,含 2% (w/w) 煤油,有限氮源,20°C 和 160 rpm。 結(jié)果代表三個獨立實驗的平均值。
生物表面活性劑粗提物的產(chǎn)量約為 1.2–1.5 g/g 干燥靜息細(xì)胞。 對于紅球菌 erythropolis 菌株 DSM 43215 [46] 和菌株 SD-74 [36],已經(jīng)建議通過靜息細(xì)胞以比生長細(xì)胞更高的產(chǎn)量生產(chǎn)生物表面活性劑。 根據(jù) Kitamoto 等人的建議,使用南極假絲酵母的靜息細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)甘露糖赤蘚糖醇脂質(zhì)。 [47] 估計與生長細(xì)胞的生產(chǎn)相比具有更低的成本。
粗生物表面活性劑的CMC
如材料和方法部分所述,使用 MTBE 從兩種紅球菌屬菌株的靜息細(xì)胞培養(yǎng)物中提取生物表面活性劑。 提取的生物表面活性劑用于測定CMC濃度。 來自菌株 LF-13 的生物表面活性劑的 CMC 約為 217 mg/L,菌株 LF-22 的 CMC 約為 269 mg/L(圖 3)。
圖 3. 從紅球菌屬靜止細(xì)胞中提取的 SAC 的 CMC。 LF-13 和紅球菌屬。 LF-22。
增強(qiáng)正十六烷的生物降解
樣品 2,僅包含含有正十六烷和來自紅球菌屬的生物表面活性劑的海水。 LF-22 沒有顯示出光密度 (OD) 的任何增加。 在 13°C 孵育 17 天后,樣品中正十六烷的量為初始量的 78.4%,略低于對照樣品(樣品 1)的 86.5%(表 4)。 由于海水經(jīng)過高壓滅菌,我們預(yù)計樣品 2 中的正十六烷不會發(fā)生任何生物降解。實驗期間表面張力沒有變化,表明添加的生物表面活性劑在海水中保持完整。
表 4. 正十六烷生物降解試驗中的細(xì)菌生長、表面張力和正十六烷殘留量(結(jié)果為兩次重復(fù)的平均值)。
用耶氏酵母的混合培養(yǎng)物 LS-DO 修正的樣品 3 顯示測得的 OD 增加了約 3 倍,表明酵母在正十六烷上生長。 17 天后,樣品中殘留的正十六烷含量為 61%(表 4)。
用酵母和生物表面活性劑修飾的樣品 4 表現(xiàn)出最高的 OD 增加,即與起始值相比增加了 4.4 倍,表明酵母在生物表面活性劑存在下生長得更快(表 4)。 正十六烷的降解率從用酵母修正時的 12 毫克/天增加到酵母和生物表面活性劑同時存在時的 30 毫克/天。 在生物表面活性劑存在下 17 天后,正十六烷耗盡。