摘要

本研究的目的是評(píng)估三種營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下十二指腸成分的變化：禁食、喂養(yǎng)和高脂肪喂養(yǎng)狀態(tài)。健康受試者在非連續(xù)日服用兩次等熱量膳食。隨后，每30分鐘采集一次十二指腸樣本，然后根據(jù)pH值、脂解產(chǎn)物、膽汁鹽、磷脂、滲透壓和表面張力對(duì)其進(jìn)行表征。由此產(chǎn)生的時(shí)間曲線顯示出波動(dòng)模式，反映了受試者之間和受試者內(nèi)部的高度可變性。高脂肪液體餐的高脂肪百分比不會(huì)改變十二指腸成分。單甘酯占總脂質(zhì)的5%至88%，是主要的脂肪分解物質(zhì)，其次是游離脂肪酸。在給藥后30分鐘內(nèi)，禁食、喂食和高脂喂養(yǎng)狀態(tài)下，個(gè)體十二指腸內(nèi)脂質(zhì)產(chǎn)物濃度分別為0.0–5.5、1.0–14.9和3.1–22.4 mg/mL。膽汁鹽的相應(yīng)值分別為2.0–9.0、6.9–9.3和4.4–30.3 mM，磷脂的相應(yīng)值分別為0.06–2.4、2.6–5.7和1.4–9.3 mM。但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具體的趨勢(shì)。這項(xiàng)研究說(shuō)明了攝入食物后可能導(dǎo)致的可變腔內(nèi)條件。由于十二指腸內(nèi)事件（如十二指腸內(nèi)溶解）影響水溶性差和/或高度親脂性藥物的吸收，這種變異性可能導(dǎo)致經(jīng)常觀察到的高度可變的藥物血漿時(shí)間曲線。

介紹

腸腔內(nèi)藥物濃度是決定藥物跨腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因素之一。最近有報(bào)道直接測(cè)量腔內(nèi)藥物濃度；1-3然而，這與各種困難有關(guān)。因此，基于體外溶解度測(cè)定的腔內(nèi)藥物濃度評(píng)估將是一種更實(shí)用的方法。4.

迄今為止，普通水緩沖液通常用于藥典溶解度測(cè)定。由于這些簡(jiǎn)單的緩沖系統(tǒng)在生理上不相關(guān)，它們的使用可能導(dǎo)致低估小腸中的溶解度，尤其是對(duì)于水溶性差和/或高度親脂性藥物。作為小腸內(nèi)容物替代物的新培養(yǎng)基很難定義，因?yàn)槟c腔的成分是各種因素（包括pH值、膽汁分泌和食物消化產(chǎn)物）相互作用的結(jié)果。在過(guò)去的十年中，為了更好地反映體內(nèi)情況，已經(jīng)做出了一些努力來(lái)提高溶解度和溶出度測(cè)定的生物相關(guān)性；最常用的替代品是禁食狀態(tài)模擬腸液（FaSSIF）和喂食狀態(tài)模擬腸液（FeSSIF）。5–9盡管進(jìn)行了多次嘗試，但對(duì)當(dāng)前使用的生物相關(guān)介質(zhì)的評(píng)論仍定期發(fā)表，包括對(duì)緩沖系統(tǒng)的評(píng)論，與膽鹽混合物相比，使用單一膽鹽種類，以及沒(méi)有脂質(zhì)消化產(chǎn)物。8,10,11此外，近年來(lái)對(duì)胃腸道環(huán)境組成的了解有所增加，尤其是在美聯(lián)儲(chǔ)國(guó)家。11–13進(jìn)餐后，膳食甘油三酯水解為單甘酯和游離脂肪酸，主要是通過(guò)十二指腸中的胰脂肪酶作用。眾所周知，這些分解脂肪的消化產(chǎn)物可以對(duì)高度親脂性化合物的溶解性產(chǎn)生積極影響。7,14–16這一知識(shí)已成功應(yīng)用于脂基給藥產(chǎn)品的配方中，以提高腔內(nèi)藥物濃度。17該信息還導(dǎo)致了一些研究，其中評(píng)估了生物相關(guān)培養(yǎng)基中脂質(zhì)產(chǎn)物，尤其是脂肪酸和單甘酯的摻入情況。7,14,16,40然而，到目前為止，尚未就優(yōu)先使用的脂質(zhì)消化產(chǎn)物的濃度、類型或鏈長(zhǎng)達(dá)成一致。此外，我們應(yīng)該意識(shí)到腔內(nèi)環(huán)境在不斷變化，特別是在進(jìn)食后：進(jìn)入的食糜會(huì)影響十二指腸的pH值；神經(jīng)和激素信號(hào)刺激膽囊收縮、胰酶流動(dòng)和腸道運(yùn)動(dòng)。這一過(guò)程是由胃和十二指腸中存在的膳食營(yíng)養(yǎng)素，特別是脂解產(chǎn)物引起的。因此，酶復(fù)合物脂肪酶-大腸桿菌酶從脂滴表面釋放單甘酯和游離脂肪酸，隨后可作為膽汁成分形成的混合膠束的一部分被吸收。18

為了進(jìn)一步提高模擬腸液（SIF）的預(yù)測(cè)能力，需要對(duì)人體腸液（HIF）進(jìn)行深入的表征。由于對(duì)進(jìn)食后小腸環(huán)境的了解相當(dāng)有限，11,12,19我們考慮了受試者間的變異性，研究了進(jìn)食后時(shí)間功能中HIF的組成和特征。此外，通過(guò)給藥不同脂肪百分比的營(yíng)養(yǎng)飲料來(lái)評(píng)估不同喂養(yǎng)狀態(tài)的效果。

材料和方法

材料

NaCl、冰醋酸、氯仿、甲醇、己烷和吡啶購(gòu)自默克公司（德國(guó)達(dá)姆施塔特）。硅烷化劑雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）從皮爾斯（伊利諾伊州羅克福德）獲得。脂質(zhì)DL-a-棕櫚酸、1,2-二棕櫚酰-rac-甘油、甘油基三棕櫚酸和棕櫚酸以及通用脂肪酶抑制劑奧利司他從Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）購(gòu)買(mǎi)。使用Maxima系統(tǒng)（Elga有限公司，英國(guó)High Wycombe Bucks）凈化水。

確保使用Plus1（荷蘭Zwolle的雅培實(shí)驗(yàn)室B.V.）模擬標(biāo)準(zhǔn)膳食。200ml的一部分能量含量為300 kcal，其中脂質(zhì)、碳水化合物和蛋白質(zhì)分別占29%、54%和17%；滲透壓為670mosm/kg；pH值為6.6。ScandishakeMix1（英國(guó)利物浦Nutricia）被用來(lái)模擬富含脂肪的膳食。按照制造商的指示制備后，一份的體積為300 mL，總能量為600 kcal，能量基礎(chǔ)上由46%的脂質(zhì)、46%的碳水化合物和8%的蛋白質(zhì)組成；滲透壓為1031mOsm/kg，pH值為6.7。

HIF的取樣

腸道液體的取樣在魯汶大學(xué)醫(yī)院進(jìn)行，并得到醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)（ML3242）的批準(zhǔn)。五名健康的白人志愿者在給予書(shū)面知情同意后被納入研究。在典型的生物利用度/生物等效性研究中選擇志愿者。三名男性和兩名女性志愿者，年齡在21至37歲之間，體重指數(shù)在22至25 kg/m2之間，參與了這項(xiàng)研究。沒(méi)有一名志愿者有胃腸病病史，并且在參與研究前7天沒(méi)有服藥。

經(jīng)過(guò)一夜禁食后，通過(guò)口腔將一根雙腔導(dǎo)管（塞勒姆集水坑管14 Ch，外徑4.7 mm，Sherwood Medical，Petit Rechain，比利時(shí)）引入十二指腸（D2–D3），并通過(guò)透視檢查其位置。這種雙腔導(dǎo)管允許通過(guò)注射器收集腸液，而不會(huì)在胃腸道（GI）中產(chǎn)生負(fù)壓。以前有報(bào)道稱，經(jīng)幽門(mén)管的存在不影響胃排空或十二指腸胃反流。20在三個(gè)非連續(xù)的日子里，志愿者在取樣前要么喝營(yíng)養(yǎng)飲料要么只喝規(guī)定量的水（250毫升）。后者被稱為禁食狀態(tài)。為了模擬一頓標(biāo)準(zhǔn)餐，攝入400毫升的水和250毫升的水。這種情況稱為美聯(lián)儲(chǔ)狀態(tài)。通過(guò)攝入300毫升斯堪的納克混合物1，然后攝入350毫升水，以獲得650毫升的總體積，從而獲得脂肪豐富的喂養(yǎng)狀態(tài)。在攝入營(yíng)養(yǎng)飲料和/或水之后，在2小時(shí)（禁食狀態(tài)）或5小時(shí)（喂食狀態(tài)和富含脂肪的喂食狀態(tài)）內(nèi)，每15分鐘對(duì)腸液進(jìn)行一次取樣（?時(shí)間點(diǎn)0），以便在整個(gè)收集期后，獲得21份喂食和富含脂肪的喂食狀態(tài)和9份禁食狀態(tài)。在含有溶于乙醇的奧利司他的試管中收集腸道樣本，以阻止體外進(jìn)一步的脂肪分解。使用1 mM奧利司他在乙醇中的儲(chǔ)備溶液使十二指腸樣品中奧利司他的最終濃度達(dá)到1 mM。該方案允許對(duì)采集的樣品進(jìn)行少量稀釋，并可忽略添加乙醇（0.1%，v/v）。如前所述，該脂肪酶抑制劑的應(yīng)用濃度為IC50（11 nM）的100倍（聯(lián)合利華食品與健康研究所，弗拉丁根，數(shù)據(jù)未公布）；樣品的成分可視為體內(nèi)成分的代表。在每個(gè)采集時(shí)間點(diǎn)之后，用5–10 mL空氣沖洗導(dǎo)管，以清潔導(dǎo)管，以便隨后進(jìn)行抽吸。在冰上收集所有吸入的液體，在4000 rpm和48℃下離心20分鐘，并測(cè)量上清液的pH值（瑞士博納杜茲漢密爾頓Slimtrode）。所有樣品在308C下儲(chǔ)存，直至進(jìn)一步分析。

樣品的處理

為每位志愿者成對(duì)收集的分?jǐn)?shù)，以獲得30分鐘的分?jǐn)?shù)，因此對(duì)于大多數(shù)分?jǐn)?shù)，有足夠的體積可用于執(zhí)行所有所需的分析。除了成對(duì)的混合組分外，通過(guò)添加等量的所有組分，為每位志愿者分別制備一個(gè)整體混合樣品（進(jìn)一步稱為混合樣品），受試者2和受試者5的禁食狀態(tài)除外（沒(méi)有足夠的體積可用）。

樣品分析

酸堿度

上清液的pH值（見(jiàn)HIF部分的取樣）在收集后立即測(cè)量（Hamilton Slimtrode）。

滲透壓

滲透壓（馬薩諸塞州諾伍德市先進(jìn)儀器公司；3250型）是根據(jù)測(cè)定250毫升樣品體積中的冰點(diǎn)降低進(jìn)行評(píng)估的。

表面張力

使用Delta-8多通道微張力計(jì)（芬蘭赫爾辛基Kibron公司）在室溫下測(cè)定表面張力。將50微升HIF添加到96孔板的每個(gè)孔中。相應(yīng)的表面張力值由g-screen軟件根據(jù)從溶液中取出金屬絲探針時(shí)測(cè)量表面張力施加的力自動(dòng)生成。

膽汁酸

根據(jù)羥基的數(shù)量、位置和方向測(cè)定膽汁酸。在堿性水解和酸化后，用二乙醚提取游離膽汁酸，然后進(jìn)行三甲基硅烷化以進(jìn)行GC-MS選擇離子監(jiān)測(cè)分析。21膽汁酸的色譜分離在DBXLB毛細(xì)管柱上進(jìn)行，恒流模式為0.8 mL/min，最終溫度為2908℃，載氣為氦氣。

以氘標(biāo)記的膽汁酸作為內(nèi)標(biāo)物。總膽汁酸濃度測(cè)定為單獨(dú)測(cè)定組（膽酸鹽、鵝去氧膽酸鹽、去氧膽酸鹽、熊去氧膽酸鹽）的總和。

總磷脂

使用Wako Chemicals（Neuss，德國(guó)）的試劑盒通過(guò)酶法測(cè)定總磷脂水平。22磷脂酶D釋放后，膽堿被膽堿氧化酶氧化，產(chǎn)生過(guò)氧化氫。隨后，過(guò)氧化物酶的作用導(dǎo)致紅色醌的形成，可通過(guò)分光光度法進(jìn)行分析。

脂質(zhì)含量

按照Armand等人12的方法提取1ml凍干十二指腸液中的脂質(zhì)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，凍干樣品溶解在含有2%冰乙酸的0.15m NaCl中。以氯仿/甲醇（2:1，v/v）為萃取溶劑。下部氯仿層在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至干燥。使用BSTFA（2%吡啶，v/v）將殘余物硅烷化。在608C下30分鐘后，將樣品溶解在己烷中，并根據(jù)Duchateau等人23所述的技術(shù)，通過(guò)GC[Fisons MFC800]和火焰離子化檢測(cè)進(jìn)行分析。所使用的色譜柱為Chrompack CP-Sil5CB-MS色譜柱，帶有失活的熔融石英預(yù)柱。樣品被注入“冷柱”，并以108C/min的升溫速率加熱至3608C。氫氣被用作載氣。注射量為0.5 mL，總運(yùn)行時(shí)間為50 min。根據(jù)碳數(shù)（CN）分離脂質(zhì)。出于我們的目的，對(duì)各峰進(jìn)行單獨(dú)整合并組合，以獲得每類中性脂質(zhì)的一個(gè)AUC值。CN 8-18、CN 20-28、CN 30-42、CN 44至end范圍內(nèi)的峰值分別指定為游離脂肪酸（FFA）、單甘酯（MG）、甘油三酯（DG）和甘油三酯（TG）。選擇這些整合范圍是為了盡量減少不同脂質(zhì)類別之間的重疊。使用各自的校準(zhǔn)曲線計(jì)算每一類的量：將棕櫚酸、單棕櫚酸、雙棕櫚酸和三棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解在己烷中，并在氮?dú)庀抡舭l(fā)適當(dāng)體積，以獲得各自標(biāo)準(zhǔn)品的已知量。提取殘余物并與未知樣品進(jìn)行相同的硅烷化。

數(shù)據(jù)分析

每個(gè)主題的所有配置文件均單獨(dú)呈現(xiàn)；只有當(dāng)無(wú)法吸入液體或沒(méi)有足夠的液體進(jìn)行分析時(shí)，數(shù)據(jù)點(diǎn)才被忽略。個(gè)人中值是指1名受試者在1種營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下的中值。綜合考慮所有五名受試者在一種特定營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下的數(shù)據(jù)，計(jì)算出總體中值。使用重復(fù)測(cè)量ANOVA結(jié)合Tukey多重比較檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較。根據(jù)梯形規(guī)則計(jì)算喂食和富含脂肪的喂食狀態(tài)下總膽汁酸和磷脂的AUC0–300 min值。對(duì)于禁食狀態(tài)，AUC0–300分鐘值是通過(guò)假設(shè)禁食個(gè)體中值是管腔內(nèi)值的客觀估計(jì)值來(lái)估計(jì)的，因?yàn)榻碃顟B(tài)在給藥后/給藥后300分鐘內(nèi)保持不變。在所有病例中，p<0.05時(shí)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。