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蛋白質(zhì)外聚物中多糖的比例——方法
來(lái)源:上海謂載 瀏覽 1381 次 發(fā)布時(shí)間:2021-10-12
二、方法
2.1. 中宇宙的實(shí)驗(yàn)方法
海水是從墨西哥灣收集的,用于填充 12 罐,每個(gè) 130 L,其中 4 個(gè)處理一式三份: 對(duì)照(海水)、WAF(用 Macondo 替代油,一種輕質(zhì)低硫原油,化學(xué)性質(zhì)類似于 在深水期間從 Macondo 井中溢出的石油 Horizon 事件)、CEWAF(Corexit + oil 比例為 1:20)和 DCEWAF (CEWAF 稀釋十倍)。 仔細(xì)描述了中間宇宙的設(shè)置 在韋德等人。 (2017) 以及準(zhǔn)備 WAF 的程序, CEWAF 和 DCEWAF。 簡(jiǎn)而言之,注入油或油 + Corexit 進(jìn)入帶擋板的再循環(huán)罐并混合約 24 小時(shí),然后將下層 分?jǐn)?shù)(即,避免表面光滑)被添加到各自的 坦克。 有關(guān)中宇宙實(shí)驗(yàn)的信息在表 1 中給出 根據(jù)估計(jì)值添加初始和最終油濃度 根據(jù) Wade 等人確定的油當(dāng)量 (EOE)。 (2011 年,2017 年)。 實(shí)驗(yàn)持續(xù) 3 到 5 天,運(yùn)行 12:12 明暗循環(huán)。 在表 1 中,對(duì)于使用沿海 用微生物濃縮物修正的水域,浮游生物(≥63 μm)是 用網(wǎng)收集并轉(zhuǎn)移到聚碳酸酯瓶中。 這個(gè) 將濃縮的浮游生物塊引入罐中并攪拌(2 L 到每個(gè))在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前。 對(duì)于公海水域和沿海水域的中宇宙,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行了修正, 添加營(yíng)養(yǎng)物(最終濃度 f/20)并攪拌罐。
表格1 中觀的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
本研究的樣品是從水柱中提取的 24 小時(shí),根據(jù) Xu 等人詳細(xì)介紹的方法進(jìn)行分析。 (2018a,2018b)。 簡(jiǎn)而言之,對(duì)于本研究,從水中提取的樣品等分試樣 通過(guò) 0.45 μm FlipMate 以 < 100 mmHg 的壓力輕輕過(guò)濾色譜柱 去除顆粒的裝置 (Environmental Express SC0301C)。 這 然后在 3 kDa 超速離心膜(Amicon Ultra-15,EMD # UFC900396)中處理 0.45 μm 濾液以收集膠體(3 kDa 截留物)級(jí)分。 收集 3 kDa 截留物并 用 18 MΩ -cm 沖洗 3 次,直到最終體積至少濃縮 25 倍。 這種 EPS 膠體部分來(lái)自水中 然后將 < 0.45 μm 和 > 3 kDa 的色譜柱用于本工作中提到的大多數(shù)測(cè)量。 測(cè)量每個(gè)EPS膠體樣品 對(duì)于蛋白質(zhì)和多糖,如下所述,并用 3 kDa 超濾滲透液(真正溶解的部分;濾液) 3 kDa 超濾器)來(lái)自用于測(cè)量的對(duì)照處理 SFT 以保持原始中宇宙樣本的離子組成。
2.2. 化學(xué)品和實(shí)驗(yàn)室器具準(zhǔn)備
除非另有說(shuō)明,所有化學(xué)品均來(lái)自 Sigma 并且是 97% 純 ACS 級(jí)或更高。 除非使用的水是天然海水,否則所有使用的水都是 18 MΩ –cm Milli-Q I 型水。 除非 指定,ASW(Millero 1996,第 67 頁(yè)),單個(gè)組件 MgCl2、NaCl 和 Na2SO4 在 450°C 下燃燒 4 小時(shí)。 所有實(shí)驗(yàn)室用品 用自來(lái)水沖洗三次,在 1% 的溶液中浸泡 12 小時(shí)。 Micro-90® 肥皂溶液(VWR,目錄號(hào) 89210-140),用 18 MΩ –cm Milli-Q 水,在 3 M HCl 中浸泡 12 小時(shí),并沖洗三次 18 MΩ –cm Milli-Q 水。 如果使用玻璃器皿,則另外 在 450 °C 下燃燒 4 h。
2.3. 標(biāo)準(zhǔn)生物大分子實(shí)驗(yàn)
為了評(píng)估蛋白質(zhì)和多糖(單獨(dú) 或組合)在 SFT 上,實(shí)驗(yàn)是在人工 海水,ASW,使用牛血清白蛋白(BSA,來(lái)自 Pierce 蛋白 檢測(cè)試劑盒,ThermoFisher),其等電點(diǎn) pI 為 4.7–5.4 (視情況而定)。 此外,為了代表多糖,我們 使用過(guò)存在于水中的葡萄糖醛酸(Sigma,CAS 6556-12-3) 墨西哥灣柱(Hung 等人,2003 年;Xu 等人,2011 年)。 它是一個(gè) 具有與 D-甘露糖醛酸相似物理化學(xué)性質(zhì)的差向異構(gòu)體和 L-古洛糖醛酸,海藻酸的主要成分和豐富的 細(xì)菌外聚合物、生物膜和褐藻的成分。 葡萄糖醛酸的 pKa 為 2.8-3.2(取決于分子構(gòu)型)。 在 pH 值為 ~8 的 ASW 中,這些部分將被去質(zhì)子化,這將增強(qiáng)它們的表面反應(yīng)性。
2.4. 表面張力
SFT 使用 Kibron EZ Pi-Plus 張力計(jì)測(cè)量,該張力計(jì) 采用 Du Nouy-Paddy 技術(shù)結(jié)合 0.5 mm 直徑探針(Padday 等人,1975 年)。 探針是金屬合金的 一種親水性氧化物,與樣品的接觸可以忽略不計(jì)。 這 聚丙烯杯中的 1.5 mL 樣品使用循環(huán)水浴保持在 22.5 ± 0.3 °C 的恒溫。 探針是 通過(guò)用丁烷炬燃燒來(lái)清潔樣品之間。 每個(gè) 樣品至少測(cè)量四次,重復(fù)測(cè)量顯示 ≤ 5% 的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。 這 儀器針對(duì) 18.2 MΩ –cm 電阻率 I 型水進(jìn)行校準(zhǔn)。 疏水部分的濃度越高 EPS 膠體分?jǐn)?shù)越低,表面張力越低。 因此,由于聚丙烯杯可能會(huì)吸附樣品中分子的更多疏水成分,因此實(shí)際的表面張力可能 低于表觀測(cè)量值,因此我們的測(cè)量值是 保守的。
2.5. 蛋白質(zhì)和多糖測(cè)定
EPS 中的蛋白質(zhì)含量是基于改良的二辛可寧酸方法(Smith 等人,1985 年)使用 Pierce 蛋白質(zhì)測(cè)定的 檢測(cè)試劑盒(ThermoFisher),以 BSA 為標(biāo)準(zhǔn)。
使用蒽酮方法(Morris 1948)測(cè)定中性糖濃度,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)。 對(duì)于蒽酮試劑,0.05 g 蒽酮(CAS 90-44-8;終濃度 1 g/L 蒽酮)溶于 50 mL 濃硫酸中 玻璃燒杯,然后攪拌。 在每次應(yīng)用此方法之前立即制備蒽酮試劑。 對(duì)于葡萄糖 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,將 50 mg 葡萄糖(CAS 50-99-7;終濃度 1 g/L 葡萄糖)溶解在 50 mL 離心管中,然后填充 用 Milli-Q 水定容至 50 mL。 標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備溶液是 稀釋至最終體積 10 mL,例如,對(duì)于 5 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)品 溶液,0.05 mL 儲(chǔ)備溶液,用 9.95 mL Milli-Q 水稀釋。 然后抽取各標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1 mL 和樣品 0.1 mL 放入單獨(dú)的 Pyrex 玻璃管中。 我們向每個(gè)管中添加了 0.2 mL 蒽酮試劑溶液并在 100°C 下加熱 10 分鐘。 之后 孵育,試管立即在冰浴中冷卻或 運(yùn)行自來(lái)水,使它們迅速達(dá)到室溫。 這 在光電色度計(jì)中在 620 nm 處測(cè)量光密度。 該方法用于測(cè)定中性糖; 它不會(huì) 檢測(cè)帶電糖,如糖醛酸。
通過(guò)添加硼酸鈉 (75 mM) 來(lái)估計(jì)糖醛酸 濃硫酸和間羥基二苯,含葡萄糖醛酸 酸作為標(biāo)準(zhǔn)(Hung 和 Santschi 2001)。
蛋白質(zhì)、中性糖和糖醛酸的濃度, 以 BSA、葡萄糖和葡萄糖醛酸當(dāng)量表示,相對(duì)于溶解的有機(jī)碳(蛋白質(zhì) 53%,40% 中性糖,糖醛酸 37%)。 然后蛋白質(zhì)與多糖的比例計(jì)算為蛋白質(zhì)/TCHO,其中TCHO(總 碳水化合物=中性糖+糖醛酸)。 因此,蛋白質(zhì):多糖的比例是(蛋白質(zhì) * 0.53)/[(中性糖 * 0.40)+(糖醛酸 酸 * 0.37),其中所有濃度均以 mg-OC/L 為單位(OC 是有機(jī)的 碳)。 EPS 組成和濃度計(jì)算公式為 從三個(gè)復(fù)制的中胚層罐中收集的樣品 每個(gè)處理(n = 3)。
2.6. 溶解有機(jī)碳測(cè)定
DOC 的濃度是在 Shimadzu TOC-L 分析儀上使用高溫燃燒法測(cè)量的(Xu 等人,2011 年;Guo 等。 1994)。 來(lái)自 0.7 um 預(yù)燃 Whatman GFF 的樣品濾液 用 2N HCl 溶液將膜酸化至 < pH 2,然后吹掃 用純空氣吹 10 分鐘以去除無(wú)機(jī)碳。 樣本是 然后在 680 °C 下燃燒并進(jìn)行 CO2 測(cè)量以確定碳量。 為了計(jì)算 DOC 濃度, 減去系統(tǒng)空白并根據(jù)校準(zhǔn)計(jì)算 曲線使用羥基鄰苯二甲酸鉀作為標(biāo)準(zhǔn)。 樣品 波動(dòng)系數(shù)超過(guò) 3% 測(cè)量 3 次, 給出最低波動(dòng)因子的兩個(gè)值的平均值是 采納。
2.7. 共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLSM)
共聚焦激光掃描顯微鏡圖像是用 蔡司 LSM 880 共聚焦光譜顯微鏡成像系統(tǒng),使用 Zstack 軟件。 所有樣品均使用人工海水制備 (ASW) 購(gòu)自 Sigma(S9883 海鹽)并以 40 g/L 配制。 為了制備 WAF,將 200 μL Macondo 替代油緩慢加入到 在 500 mL 硼硅玻璃制成的瓶子中過(guò)濾 ASW 海水 帶有特氟龍襯里的帽子。 攪拌混合物并使其平衡24小時(shí)以制備WAF。 CEWAF 的制作方式相同,除了 在混合之前,Corexit 以 1:20 的 Corexit 與油的比例添加 與 ASW(Chiu 等人,2017 年;Wade 等人,2017 年)。 Corexit 治療 除了將 Corexit 添加到 ASW 組成 0.1% 的溶液。 溶液終濃度 BSA 和海藻酸 (Sigma, CAS 9005-38-3) 的濃度也為 0.1%。 這 將 500 mL 處理液倒置幾次,然后將 20 μL 等分試樣移液到載玻片上,與 100 mM 金霉素孵育 (CTC, Sigma CAS 64-72-2) 染料溶液在每次處理約 30分鐘。 如染料分布所示,分子擴(kuò)散在小體積內(nèi)快速。 圖像是在激發(fā)/發(fā)射 495 nm/519 nm 在 1 毫秒的時(shí)間內(nèi)。
2.8. 掃描電子顯微鏡 (SEM)
SEM 樣品首先過(guò)濾到 0.03 um 聚碳酸酯上 跟蹤蝕刻膜過(guò)濾器(SPI Supplies, West Chester, PA, USA),然后 使用 4% 多聚甲醛固定,然后用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 洗滌,然后用去離子水沖洗(Tsai 等人,2017 年)。 使用 30%、50%、75%、95% 和 100% 的甲醇完成脫水(Tsai 等人,2017 年)。 使用 CO2 臨界點(diǎn)干燥器去除 任何殘留溶劑。 最后,在上面濺射鍍上一層薄薄的金 這些基材。 然后使用 FEI Quanta 200 獲取圖像 ESEM 系統(tǒng)(Tsai 等人,2017 年)。
蛋白質(zhì)外聚物中多糖的比例——摘要、簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)外聚物中多糖的比例——結(jié)論、致謝!