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采用殼聚糖-三聚磷酸酯-百里香納米顆粒經(jīng)熱噴墨打印而成的新型活性包裝材料——材料和方法

來源:Unisense 瀏覽 1857 次 發(fā)布時間:2021-09-13


材料和方法


2.1.材料


2.1.1.藜麥粉


(Chenopodium quinoa Willd.)由"Cooperativa Las Nieves"(智利VI地區(qū))提供。面粉在4℃下儲存直至使用。


2.1.2.殼聚糖


殼聚糖薄膜(Qo)。殼聚糖膜(Qo)脫乙酰度為88.5%的脫乙酰度為88.5%的殼聚糖膜(Qo)來自蟹殼的NMR-H1和600 kDa的Mwn,購自SigmaeAldrich,USA(C48165)。


殼聚糖納米顆粒低分子量殼聚糖Qo(QoLMW)購自SigmaeAldrich,Inc.(St.Louis,MO,USA,C448869),具有以下特性:比濃粘度(hsp/c)?203(mL/g),粘度平均值摩爾質(zhì)量(Mv)=269 kDa,通過NMR-H1測量的脫乙酰度為78.3%(Lavertu等,2003)。特性粘度在0.1 M乙酸(HOAc)+0.2 M NaCl中以25℃測定。粘均分子量通過使用該溶劑中的MarkeHowink常數(shù)確定,K 1/4 1.81E?03 mL/g,a 1/4 0.93(Rinaudo,Milas,&Le Dung,1993;Tapia,Montezuma,&Yazdani-Pedram,2008).


2.1.3.細(xì)菌菌株


金黃色葡萄球菌ATCC 25923(金黃色葡萄球菌);大腸桿菌ATCC 25922(大腸桿菌);銅綠假單胞菌ATCC 27853(銅綠假單胞菌);S.enterica serovar Typhimurium ATCC 14028(S.typhimurium);產(chǎn)氣腸桿菌ATCC 13048(產(chǎn)氣腸桿菌);和Listeria innocua ATCC 33090(L.innocua)從Instituto de Salud Pública,Santiago,Chile獲得,用于抗菌活性測試。


2.2.印膜準(zhǔn)備


2.2.1.EPQ的準(zhǔn)備


EPQ根據(jù)Abugoch等人的方法制備。(2011)和Valenzuela等人。(2013)。藜麥粉懸浮在蒸餾水(18 g/100 mL)中,并用1 M NaOH將pH值調(diào)節(jié)至11。懸浮液在室溫下攪拌60分鐘,然后在21,000?g 15℃30分鐘。根據(jù)布拉德福德方法(Bradford,1976)測量可溶性蛋白質(zhì)含量并表示為蛋白質(zhì)毫克數(shù)/毫升。EPQ是在每次需要時在使用前準(zhǔn)備的。


2.2.2.Qo解決方案的制備


制備由1.5和2 g/100 mL Qo的檸檬酸(0.1 M)組成的溶液。將溶液超聲30分鐘(Fisher Scientific FS30H,德國)并在4℃下儲存過夜以消除氣泡。溶液在4℃下儲存直至使用。


2.2.3.膠片準(zhǔn)備


Qo薄膜由高分子量和高粘度Qo(1.5%和2.0%w/v檸檬酸在0.1 mol/L中)制成。將這些溶液(48.5±0.1 g)澆鑄在低密度聚乙烯(直徑1/4 8.5 cm)板上。在50℃下將薄膜干燥至恒重。從1.5%w/v的Qo溶液中獲得的薄膜的表面固體密度為0.013 g固體cm-2次方。


Qo和EPQ的共混物是通過將在pH 11(6.7%w/v)和Qo(1.5%和2.0%w/v檸檬酸的0.1 mol/L)下獲得的EPQ溶液以不同的Qo/EPQ比率(90:10、80:20、70:30、60:40和50:50%v/v)。將混合物的pH值調(diào)整為3.0(Valenzuela等人,2013年)。成型和干燥如對Qo所述進(jìn)行。小心地從板上取下干燥的薄膜,并在測試前在22℃和60%的相對濕度下調(diào)節(jié)3天。從Qo/EPQ比為90:10的Qo(1.5%w/v)和EPQ混合獲得的薄膜的表面固體密度為0.011 g固體cm?


2.2.3.NP制備


NQ是按照Calvo、Remu~n?an-L?opez、Vila-Jato和Alonso(1997)描述的程序制備的。在0.1 M檸檬酸中制備0.3%(w/v)QoLMW溶液并攪拌24小時。TPP制備的終濃度為1.0 mg/mL。將Qo溶液(輸液泵KDS200,KD Scientific©)以2:1(v/v)TPP:Qo的比例逐滴加入TPP溶液(1.8 mL/min)并在室溫下劇烈磁力攪拌(Calvo等等,1997)。所得懸浮液在21,000?g以14度離心30分鐘(HermLe model Z32K,Wehingen,Germany)。


根據(jù)上述相同程序制備負(fù)載Th的Qo NPs(NQoThs)。制備Th(Sigma,USA,CT0501)溶液(0.1 M檸檬酸中的0.1%(w/v))并將其添加到QoLMW溶液中。將Qo/Th溶液滴加到TPP溶液中。


2.4.NQoThs的油墨配方


使用兩種不同的油墨配方將納米顆粒印刷到可食用薄膜上。根據(jù)Buanz等人的方法,通過將4.4±0.1 mg/mL NQoThs以20%或30%(v/v)分散在甘油中制備含有NQoTh薄膜的墨水。(2011)。將油墨分散體超聲處理(Fisher Scientific FS30H)30分鐘并在環(huán)境溫度下儲存直至使用。


2.5.NP的表征


2.5.1.Zeta電位、PDI和粒子流體動力學(xué)直徑


Zeta電位、PDI和粒子流體動力學(xué)直徑使用Zetasizer Nano ZS-20(Malvern儀器)在4.0mW和633 nm下操作,固定散射角為173度,在25度下測量。在毛細(xì)管樣品管內(nèi)包含的NQos和NQoThs的10 mL溶液(20%和30%甘油,w/v)中評估樣品。


2.5.2.粘度測量


使用Ostwald U型管粘度計(B號,Technico,英國)在溫控水?。?5冷凝)(Grant Instruments Ltd.,Cambridge,UK)中測量粘度。蒸餾水用作參考。


2.5.3.表面張力測量


用Kibron微張力計(Kibron Inc.,F(xiàn)inland)使用50 mL樣品溶液測量表面張力。該儀器用蒸餾水作為參考進(jìn)行校準(zhǔn)(表面張力?72.8 mN m1次方,25負(fù)降溫)(Buanz等,2011)。


2.5.4.透射電子顯微鏡(TEM)


飛利浦Tecnai 12 Bio Twin透射電子顯微鏡用于觀察納米顆粒的形態(tài)。將一滴納米顆粒分散體涂在涂覆的銅網(wǎng)上,然后在室溫下干燥,然后進(jìn)行TEM分析。


2.5.5.接觸角


基于滴落法(Kwok&Neumann,1999)評估Qo和Qo/EPQ薄膜上NQoTh分散體的接觸角測量值(n=10)。用微量移液管(Gilson Pipetman U2)形成NQoTh分散體的小液滴(2.0 mL)。在將液滴放置在薄膜上30秒后,使用光學(xué)系統(tǒng)獲取液滴的圖像。光學(xué)系統(tǒng)由連接到CCD相機(jī)(Pulnix,Inc.,San Jose,CA,USA)的變焦視頻鏡頭(Edmund Optics,NJ,USA)組成,使用ImageJ軟件(美國國立衛(wèi)生研究院,美國)與插件Drop Shape Analysis(Drop-analysis,2011)。


2.6.使用NQoThs制作電影


所有實驗均使用未經(jīng)修改的Deskjet 4000k210熱噴墨打印機(jī)(HewlettePackard Inc.)進(jìn)行。黑色墨盒(型號HP 675,cn690A)通過切掉頂部,去除泡沫墊,用蒸餾水沖洗掉墨水,然后用無水乙醇沖洗掉。墨盒裝有20 mL的NQoTh分散體,以印刷在Qo和Qo/EPQ薄膜上。打印模板為Word 2007(微軟公司)編制的8.8*8.8平方厘米的面積。打印設(shè)置適用于提供的最高分辨率的黑色墨盒(600 dpi提供180 pL/drop,HewlettePackard Inc.,2012,Pagewide技術(shù))。每次使用后,用蒸餾水和無水乙醇沖洗小柱(Buanz等,2011)。NQoThs由TIJ印刷在膠片上。該方法包括三個步驟。第一個是通過添加20%和30%(w/v)的甘油制備NQoThs的水分散體,這會減少溶質(zhì)的結(jié)晶,防止打開鎖定的打印頭(Buanz等人,2011年),以及修改液體的表面張力和粘度(Khan等人,2010年;Kipphan,2001年)以確保NQoTh分散體作為微滴的適當(dāng)遞送。第二步和第三步包括將分散體放置在改進(jìn)的打印頭中,并將分散體打印在Qo和Qo/EPQ薄膜上。


對于Qo薄膜,印刷面積為77.44平方厘米,厚度為0.02厘米,印刷體積為1.56立方厘米。為此,使用了HewlettePackard 4000k210型打印機(jī)。打印參數(shù)是顏色選擇(黑色墨水)和最大分辨率(600 dpi),這允許傳送體積為180 pL的墨滴(HewlettePackard Inc.,Pagewide技術(shù))。含20%和30%甘油的NQoThs的儲備分散體中Th的初始濃度分別為120.15和105.13 ppm。


2.7.印刷Th的測量


印刷的可食用薄膜(16平方厘米)在3 mL 1 M HCl中研磨直至完全崩解,過濾(0.45 mm Durapore PVDF Millipore),在21,000?g 20℃30 min,正己烷萃取。根據(jù)Garsuch和Breitkreutz(2010)以及Pan、Chen、Davidson和Zhong(2014)的方法,通過紫外分光光度法在273 nm處測量上清液中的Th。


Th的理論和實驗濃度使用以下公式計算:


理論計算

where

ThL ? Th Loaded in mg/cm3,

cd ? Th concentration in the dispersion of NQoThs, in mg,

dv ? drop volume in printing (resolution in dpi), in L/平方厘米,

PL ? number of printed layers on the film, and

t ? Film thickness, in cm.




實驗計算


where

ThL ? Th Loaded, in mg/cm3,

cf ? Th concentration in the film, in mg,

Pa ? Printed area, in 平方厘米, and

t ? Film thickness, in cm.




摻入效率(%)


where:

IE ? Th incorporation efficiency (%),

EL ? Experimental Load, and

TL ? Theoretical Load.




2.8.薄膜結(jié)構(gòu)特性


2.8.1.X射線衍射


X射線衍射是使用Siemens D-5000粉末X射線衍射儀和CuKa輻射(l 1.54埃;0.02度)進(jìn)行的。選擇1.7-80度的θ范圍來分析晶體結(jié)構(gòu)。對Qo和Qo/EPQ印刷薄膜進(jìn)行X射線分析。


2.8.2.薄膜微結(jié)構(gòu)


通過在Hitachi TM臺式顯微鏡(軟件TM3000)上的掃描電子顯微鏡(SEM)對所選薄膜的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。在檢查之前,使用雙面膠帶將薄膜安裝在直徑為10毫米的圓柱形模具中,然后在氬氣氣氛(PELCO 91000)中以20 kV的電壓濺射鍍金3分鐘,以使其具有導(dǎo)電性。


2.8.3.薄膜的機(jī)械性能


拉伸機(jī)械性能在配備500 N稱重傳感器的萬能拉伸試驗機(jī)(LLOYD型號LR5K,英國)上測定。


拉伸強(qiáng)度(TS)和斷裂伸長率(%E)使用智利官方標(biāo)準(zhǔn)方法(NCh1151,1999)測定,該方法等效于ISO R1184-1970標(biāo)準(zhǔn)方法。薄膜樣品被切成10毫米?50毫米的條帶,并使用雙夾鉗以30毫米的間隔以20毫米/分鐘的測試速度進(jìn)行測試。記錄曲線載荷與伸長的關(guān)系,直到達(dá)到斷裂伸長率。TS以MPa表示,并通過將最大載荷(N)除以橫截面積(m2)計算得出。最大斷裂伸長率或%E是通過將斷裂時的伸長率除以樣品的初始標(biāo)距并乘以100來確定的。報告的TS和%E值是對每種類型的樣品進(jìn)行的至少四次測量的平均值電影。


2.8.4.厚度


薄膜厚度(mm)是在薄膜樣品上確定的,并通過數(shù)字千分尺(Mitutoyo 293340)進(jìn)行測量;每部電影平均得分為九分。


2.9.水蒸氣滲透率(WVP)


WVP測量是根據(jù)智利官方標(biāo)準(zhǔn)方法(NCh2098,2000)進(jìn)行的,該方法等效于ASTM D1653-93和DIN 52615標(biāo)準(zhǔn)方法,使用濕杯法并測試每個樣品的六個薄膜。杯中裝滿蒸餾水至距頂部邊緣6毫米的高度。用硅膠將薄膜密封在杯子上。將杯子置于冷藏相機(jī)中,溫度為0±0.6℃,相對濕度為85±2%。稱量杯子的重量直至恒重。WVP是從方程估計的。(4)根據(jù)McHugh、Avena-Bustillos和Krochta(1993)。

其中WVP=水蒸氣滲透率,單位g mm m-2次方h-1次方Pa-1次方;ε=厚度mm;m=質(zhì)量隨時間的變化,單位為g;t=h中的時間;A=薄膜面積,m2;和DP=杯內(nèi)薄膜表面的校正水蒸汽分壓e柜內(nèi)薄膜外表面的水蒸汽分壓。


2.10.從印刷的可食用薄膜中釋放納米封裝的Th


使用Franz連續(xù)垂直擴(kuò)散池(Gilson Inc.Middleton,WI 53562)測定Qo和Qo/EPQ薄膜中NQoThs的釋放。細(xì)胞的有效擴(kuò)散面積為4.7平方厘米。將薄膜安裝在受體和供體隔室之間(印刷面朝下)。接受室充滿1.5mL蒸餾水并保持在20℃。每天從受體中取出1.5 mL樣品。將流量調(diào)整為3 mL/天,持續(xù)8天。使用紫外分光光度計(見2.5)在273 nm處測定樣品的Th。結(jié)果表示為每厘米3薄膜釋放的Th毫克數(shù)。


2.11.抗菌活性


2.11.1.接種物的制備


金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣大腸桿菌和無害李斯特菌分別在10 mL胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)中在搖床中以37毫升培養(yǎng)24小時。細(xì)菌的光密度(OD)在標(biāo)準(zhǔn)McFarland標(biāo)度上調(diào)整為0.5。獲得的細(xì)胞最終濃度約為10-5次方—10-6次方CFU/mL。


2.11.2.NQo和NQoTh分散體的最小抑菌濃度(MIC)


評估了納米顆粒對腐敗細(xì)菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣大腸桿菌和無害乳桿菌生長的AM。


從儲備分散體(4.4±0.1 mg/mL)制備NQoTh分散體的系列稀釋液,直到濃度降低到10%。MIC被記錄為在37℃(無濁度)Yoksan和Chirachanchai(2010)下孵育24小時后導(dǎo)致微生物無可見生長的最低濃度。


2.11.3.圓盤擴(kuò)散法的抗菌活性


根據(jù)Bauer、Kirby、Sherris和Turck(1966)和NCCLS(國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會,1990)。


將在20%甘油中印有NQoThs的兩層薄膜切成6 mm2的圓盤(以獲得3.0 mg/mm3 Th)并放置在接種有以下物質(zhì)的懸浮液(0.1 mL of 106 CFU/mL)的Müller-Hinton瓊脂平板表面上每個微生物。為了比較參數(shù),使用未印刷的薄膜(對照)和在沒有Th的情況下制備的在20%甘油中含有NQos的印刷薄膜。37℃培養(yǎng)24h,通過測量無微生物生長區(qū)域的直徑來估計抑菌圈。


2.12.統(tǒng)計分析


每個實驗至少進(jìn)行3次,每次分析一式三份進(jìn)行。通過方差分析對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并使用Tukey的多極差檢驗(Statgraphic 4.0版)測量平均值之間的顯著差異。使用<0.05的p值來確定顯著性。



采用殼聚糖-三聚磷酸酯-百里香納米顆粒經(jīng)熱噴墨打印而成的新型活性包裝材料——摘要、簡介

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