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兩種抗菌肽與生物膜之間的相互作用的比較——結(jié)果和討論、結(jié)論
來源:上海謂載 瀏覽 1453 次 發(fā)布時(shí)間:2022-01-12
結(jié)果
抗菌肽在脂質(zhì)單層中的滲透
通過測量表面壓力的增量,觀察到抗菌肽在不同初始表面壓力(π0)下嵌入到空氣/水界面上的脂質(zhì)單層中(?π)將肽添加到亞相后(Brockman,1999;Verger和Pattus,1976)。Magainin 2在π0>12 mN/m時(shí)容易插入SOPC單層(圖1A),而在π0以上≈35 mN/m時(shí),其在膜中的滲透被消除,因此該值表示該肽與SOPC膜相互作用的臨界包裝壓力πc。根據(jù)其凈正電荷4(Matsuzaki,1998),當(dāng)膜中酸性磷脂POPG的含量增加時(shí),magainin 2向脂質(zhì)單層的滲透逐漸增強(qiáng)(圖1 A)。因此,消除magainin 2插入單層的πc值增加至~39(XPG=0.1)、43(XPG=0.2)和46 mN/m(XPG=0.4)(圖1c)。相反,在SOPC膜中加入膽固醇(Xchol=0.1)對magainin 2的滲透沒有顯著影響(圖1A)。
吲哚西丁的π也顯著增加,顯示其插入SOPC單層(圖1b)。然而,吲哚青素的膜活性明顯高于magainin 2,具有πc≈65mN/m,用于SOPC膠片。與magainin 2類似,單層中POPG含量的增加增強(qiáng)了吲哚青霉素的滲透,增加了?π低于~38 mN/m,與肽和脂質(zhì)單層之間的靜電相互作用一致。然而,在后一個(gè)表面壓力值之上,吲哚西丁引起的π增量被POPG減弱。因此,與magainin 2相反,在存在POPG的情況下,πc減?。▓D1c),在XPG=0.4時(shí)從~65 mN/m(對于SOPC單層)變?yōu)閪50 mN/m。在SOPC單層中,吲哚西丁增加的π也被膽固醇(X=0.1)增加,而πc降低至~54 mN/m。圖1所示的magainin 2和吲哚西丁的模式非常不同,后一種肽的明顯交叉點(diǎn)為~38 mN/m。
抗菌肽對雙層脂質(zhì)動力學(xué)的影響
繼上述單層研究之后,有興趣探索肽對脂質(zhì)動力學(xué)的影響。這是通過使用熒光光譜和不同脂質(zhì)成分的LUV完成的,記錄芘標(biāo)記的熒光磷脂類似物PPDPC或PPDPG的發(fā)射光譜(均為X=0.01)。對于SOPC LUV,添加magainin 2導(dǎo)致芘熒光顯著猝滅,芘單體和準(zhǔn)分子發(fā)射強(qiáng)度平行降低,如Im所示(圖2)。作為XPG的一項(xiàng)功能,還研究了馬蓋寧2與脂質(zhì)體結(jié)合的后果。當(dāng)XPG從0.1增加到0.4時(shí),觀察到由于magainin 2在398 nm處逐漸增強(qiáng)的Im(RFIm),而Im的初始增量在明確定義的PG/magainin 2化學(xué)計(jì)量比~2、3和5時(shí)趨于平穩(wěn)(圖2 A)。在這個(gè)初始階段之后,直到給定的化學(xué)計(jì)量比,還有第二個(gè)過程,其斜率也隨著XPG的增加而增加(圖2b)。在XPG=0和0.1時(shí),Magainin 2僅引起Ie/Im的輕微變化,而在XPG=0.2和0.4時(shí),分別減少10%和25%是明顯的(圖3 A)。為了區(qū)分脂質(zhì)動力學(xué)中兩種性質(zhì)不同的變化,即側(cè)向遷移率和微結(jié)構(gòu)域形成,作為上述Ie/Im變化的根本原因,我們還通過測量DPH的熒光各向異性r來評估?;滍樞虻淖兓▓D3 B)。在缺乏酸性磷脂的情況下,Magainin 2幾乎不會引起r的變化(圖3B)。然而,隨著XPG的增加,加入magainin 2后脂質(zhì)堆積和酰基鏈順序逐漸增加(圖3b),XPG=0.4時(shí),r最大增加1.4倍。值得注意的是,XPG=0.1時(shí)Ie/Im沒有變化以及?;滍樞虻脑黾颖砻鱌PDPG正在發(fā)生微觀富集。有趣的是,在存在膽固醇(Xchol=0.1)的情況下,由于馬蓋寧2的作用,Im和Ie都顯著降低,Ie/Im的變化不顯著(圖2A和3A)。如前所述(van Ginkel et al.,1989),添加肽前r的增加(圖3 B)揭示了通過在膜中摻入膽固醇而增強(qiáng)的膜順序。然而,在膽固醇存在的情況下,magainin 2對r沒有進(jìn)一步的影響(Xchol=0.1,圖3b)。
隨后,我們進(jìn)行了與上述相同的測量,但使用吲哚西丁。與magainin 2類似,吲哚西丁也導(dǎo)致SOPC LUV的Im和Ie同時(shí)減少,如圖4a所示。然而,與magainin 2相反,當(dāng)存在酸性磷脂POPG時(shí),芘熒光的猝滅也很明顯。當(dāng)肽/脂摩爾比為1/20時(shí),Im按XPG?0.40.20.10順序下降。當(dāng)XPG=0.4且肽/脂摩爾比>1:12.5時(shí),Im值進(jìn)一步降低。吲哚西丁引起的Im最大減量為15%(XPG=0)至40%(XPG=0.4)。盡管Im降低,但I(xiàn)e/Im未顯示因吲哚西丁引起的顯著變化(圖4b)。有趣的是,在Xchol=0.1時(shí)測量到Im的最大下降(圖4a)。與magainin 2類似,當(dāng)吲哚西丁添加到SOPC LUV中時(shí),DPH各向異性r保持不變(圖5a)。然而,在含有酸性磷脂的膜中,吲哚西丁導(dǎo)致脂質(zhì)堆積增加和?;滍樞蛟黾?,明顯表現(xiàn)為r增加(圖5a)。此外,r的增加取決于XPG,隨著雙層中酸性磷脂含量的增加而增加(圖5b)。相應(yīng)的最大增幅為1.05倍至1.39倍。在膽固醇存在的情況下,也觀察到吲哚肽引起的膜?;滍樞虻脑黾樱箁增加1.06倍(圖5a)。
抗菌肽對膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響
由于上述magainin 2和吲哚西啶對單層和LUV具有明顯的脂質(zhì)成分依賴性作用,因此有興趣使用巨型脂質(zhì)體比較這些肽對宏觀膜的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響,無論是否含有PG,都可以在交流電場中形成由SOPC組成的巨大脂質(zhì)體。即使暴露于大量肽(~2 fmol,~4 pl=200次重復(fù)注射,數(shù)據(jù)未顯示),SOPC膜也不受magainin 2的影響。同樣,由SOPC和膽固醇(Xchol=0.1)組成的巨大脂質(zhì)體也不受此量的馬蓋寧2的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。然而,在存在POPG(XPG=0.1)的情況下,已經(jīng)~0.01 fmol(單次~20 fl注射)的magainin 2應(yīng)用于巨大囊泡表面,顯著影響巨大脂質(zhì)體膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖6 B)。更具體地說,在~1分鐘內(nèi),小顆粒(θ≈0.9米)出現(xiàn)在巨大的囊泡內(nèi)。隨后注射高達(dá)~0.1 fmol(約200 fl)的magainin 2不會引起進(jìn)一步的可見變化。在總共添加約0.2 fmol的肽后,膜開始起伏,形成致密顆粒(θ≈4 m)在巨大脂質(zhì)體內(nèi)可見(圖6 C)。在~5分鐘內(nèi),幾個(gè)小顆粒(θ≈0.9 m)出現(xiàn)在巨大脂質(zhì)體膜的內(nèi)表面(圖6 D)。隨后,大多數(shù)小顆粒進(jìn)入巨大囊泡的內(nèi)腔。這些內(nèi)吞小泡似乎在巨大脂質(zhì)體內(nèi)自由移動,在隨后30分鐘的觀察中沒有進(jìn)一步的變化。進(jìn)一步注射magainin 2,提供總共0.3 fmol的肽,引起類似內(nèi)吞作用的過程,出現(xiàn)直徑約8 m的致密顆粒(圖6 E)。約10分鐘后,巨大脂質(zhì)體內(nèi)約0.9-m顆粒的數(shù)量繼續(xù)增加。偶爾,這些顆粒也出現(xiàn)在巨大囊泡的外表面,并釋放到外部緩沖液中(圖6 E)。隨后添加magainin 2(~0.7 fmol)使膜不穩(wěn)定并誘導(dǎo)進(jìn)一步的囊泡形成(圖6 F)。這些內(nèi)吞囊泡在巨大脂質(zhì)體內(nèi)彼此分離,巨大囊泡的大小明顯減?。▓D6f)。最終,在進(jìn)一步添加magainin 2(高達(dá)~1.5 fmol)后,巨大的脂質(zhì)體膜崩塌。上述形態(tài)學(xué)變化具有高度的可重復(fù)性。
隨后,我們研究了吲哚西丁對由SOPC及其與POPG(XPG=0.1)的混合物組成的巨大脂質(zhì)體的影響。對于SOPC巨型脂質(zhì)體,唯一明顯的變化是在其表面應(yīng)用~2 fmol(~200次注射)吲哚西丁后出現(xiàn)輕微收縮(數(shù)據(jù)未顯示)。然而,當(dāng)囊泡含有POPG(X=0.1)時(shí),吲哚西?。▇0.5 fmol)誘導(dǎo)類似內(nèi)吞作用的過程(圖7),巨大脂質(zhì)體內(nèi)出現(xiàn)小顆粒(~0.9 m)。添加約0.5 fmol吲哚西?。?0次注射)后,暴露于吲哚西丁的巨大脂質(zhì)體表面區(qū)域變暗,折射率發(fā)生顯著變化,表明形成緊密堆積的三維結(jié)構(gòu),僅部分保留在焦平面內(nèi)(圖7b)。小粒子(θ)≈在上述聚集體形成后約1分鐘內(nèi),巨大脂質(zhì)體內(nèi)出現(xiàn)0.9 m(圖7 C)。隨后再添加0.1 fmol吲哚西啶后,膜表面的聚集物仍然存在,更多的小直徑顆粒出現(xiàn)在巨大的囊泡內(nèi)(圖7,DF)。這種類似內(nèi)吞作用的過程在隨后添加吲哚西丁的情況下重復(fù),大量小顆粒逐漸積聚在巨大脂質(zhì)體內(nèi),并且巨大脂質(zhì)體的大小略有減小。
隨后,我們研究了吲哚西丁對由SOPC和膽固醇組成的巨大脂質(zhì)體(Xchol?0.1)的影響。吲哚西丁在膽固醇存在的情況下也會引起巨大脂質(zhì)體的起泡。形成的內(nèi)吞小泡在巨大小泡的表面上深度聚集(圖8b)。具體地說,在添加約0.2 fmol吲哚西啶(~400 fl,20次注射,圖8 B)后約5 s內(nèi),巨大脂質(zhì)體表面出現(xiàn)一簇小顆粒。隨后,聚集物轉(zhuǎn)移到巨大的脂質(zhì)體中,同時(shí)也有少量內(nèi)吞顆粒(θ≈0.9米)處可見。進(jìn)一步添加吲哚西丁會增加這些顆粒的數(shù)量,并導(dǎo)致巨大脂質(zhì)體收縮。然而,即使在暴露于~2 fmol吲哚西?。?00次注射,數(shù)據(jù)未顯示)的情況下,膜大體上仍保持完整。
討論
馬蓋寧2和吲哚青霉素的膜活性
單層實(shí)驗(yàn)顯示,magainin 2和吲哚西啶具有高度的膜活性(圖1),在空氣/水界面上的脂質(zhì)膜下注射后,表面壓力顯著增加。根據(jù)膜的組成,發(fā)現(xiàn)了與表面壓力πc對應(yīng)的臨界堆積密度,超過該密度,這些肽不再與單層相互作用,從而導(dǎo)致π的增加(Verger和Pattus,1976)。盡管這兩種肽插入兩性離子磷脂酰膽堿單分子膜,但它們優(yōu)先與酸性磷脂相互作用,與其凈陽離子電荷保持一致(Matsuzaki等人,1991、1993、1995a、1998;Ladokhin等人,1997)。然而,PG對其穿透力的影響明顯不同,吲哚西丁在~38 mN/m的表面壓力下有一個(gè)交叉點(diǎn),吲哚西丁的斜率為?存在PG時(shí),π與π0的比值變得更陡(圖1)。相比之下,斜坡??與π0相比,magainin 2的穿透力未因PG的存在而改變(圖1A)。我們的數(shù)據(jù)表明,magainin 2更表面地附著于單層,其穿透深度增加PG,并隨著表面壓力的增加而逐漸減小,其長軸相對于層平面的角度在不同壓力下保持相對不變。上述magainin 2與脂質(zhì)單分子膜的相互作用模式可兼容1)其主要為=-螺旋構(gòu)象,PG增加=-螺旋度(Wieprecht et al.,1997),和2)該肽在其長軸平行于層平面的情況下向脂質(zhì)雙層的淺層滲透(Bechinger等人,1993年;Matsuzaki等人,1994年)。在π>πc時(shí),magainin 2仍可能與單層中的PG靜電結(jié)合,盡管沒有穿透膜,因此不會導(dǎo)致π增加。最后,我們的數(shù)據(jù)還表明,與雙層不同,magainin 2不會在脂質(zhì)單層中采用垂直方向(即其=-螺旋的長軸垂直于層平面)。
對于測試的所有單層組成,吲哚青霉素的πc值超過了馬蓋寧2的測量值(圖1 c),表明該肽在酰基鏈之間有效插入和插層。吲哚西丁在~38 mN/m的交叉點(diǎn)值得關(guān)注。在后一個(gè)表面壓力之下,表面壓力的增量??在PG存在的情況下,吲哚西丁引起的反應(yīng)增強(qiáng),而在較高的初始脂質(zhì)堆積密度下觀察到相反的反應(yīng)。有趣的是,不管脂質(zhì)成分(即PG的存在)如何,交叉點(diǎn)幾乎保持不變,因此表明它可以完全由表面壓力決定,而不管靜電相互作用如何。一種可能的機(jī)制是,在π0>38 mN/m時(shí),吲哚西丁以壓力依賴的方式改變其在單層中的取向,可能是從其長軸相對于層平面的平行到垂直取向(圖9,B和C),從而減少面積/肽并減少?π.此外,一些靜電結(jié)合吲哚肽的PG分子也可能與單層中的磷脂方向不同。換句話說,吲哚西丁與其相關(guān)的PG將形成一種超分子復(fù)合物,其取向?qū)⑷Q于壓力。這在圖9中示意性地示出。重要的是,所提出的肽連接磷脂的重新定向?qū)⑴c最近提出的模型兼容,在該模型中,穿過雙層的孔表面的一部分將由脂質(zhì)頭基構(gòu)成(Ludtke et al.,1996)。
magainin 2和吲哚西啶對雙層脂質(zhì)動力學(xué)的影響
雖然熒光光譜顯示,馬蓋寧2和吲哚西啶對脂質(zhì)動力學(xué)的影響存在明顯差異,但也存在一些明顯的相似之處。因此,DPH各向異性r的增加表明,在存在酸性磷脂的情況下,這兩種肽都會導(dǎo)致酰基鏈順序的增加,這種影響的程度隨著XPG的增加而增加(圖3b和5b)。同樣,在膽固醇存在的情況下,兩種肽對芘熒光的有效猝滅也很明顯(圖2a和4a)。這可能與膽固醇的OH基團(tuán)和馬蓋寧的E19殘基之間的相互作用有關(guān)(Tytler等人,1995年),該肽在膜中具有跨膜取向。當(dāng)Xchol=0.1時(shí),r值的增加是由于吲哚西丁所致,而馬加寧則無影響。這表明,在膽固醇存在的情況下,吲哚肽可能采用跨雙層取向,其長軸垂直于雙層平面。
這兩種抗菌肽對芘標(biāo)記的磷脂類似物的猝滅機(jī)制令人感興趣。可能涉及π-陽離子相互作用(Dougherty,1996),后者由肽的堿性殘基表示。吲哚西丁具有較高的Trp含量(39%),可促進(jìn)其分配到脂質(zhì)雙層(Wimley和White,1996)。因此,芘和色氨酸之間的π-相互作用也是可能的。已經(jīng)證明,色氨酸可以淬滅膠束溶液中各種芘衍生物的熒光發(fā)射(Encinas和Lissi,1986;Altamirano等人,1998)。另一種可能性是鏈反轉(zhuǎn)(Holopainen et al.,1999),通過肽與脂質(zhì)雙層結(jié)合,導(dǎo)致芘部分調(diào)節(jié)到更極性的環(huán)境中,從而增加熒光團(tuán)微環(huán)境的極性,并導(dǎo)致量子產(chǎn)率降低。
除上述相似性外,當(dāng)使用芘標(biāo)記的脂質(zhì)類似物研究酸性磷脂對脂質(zhì)動力學(xué)的影響時(shí),兩種肽之間也存在明顯差異。Magainin 2導(dǎo)致兩性磷脂組成的LUV的芘發(fā)射顯著猝滅(圖2A)。然而,在PG存在的情況下,芘的單體強(qiáng)度增加,XPG逐漸增加了這種效應(yīng)的幅度(圖2A)。圓二色性、拉曼光譜、傅里葉變換紅外光譜和固態(tài)核磁共振研究表明,馬蓋寧在與脂質(zhì)雙層結(jié)合時(shí)采用螺旋構(gòu)象(Matsuzaki等人,1989年、1991年;Williams等人,1990年;Jackson等人,1992年;Bechinger等人,1993年;Wieprecht等人,1997年;Hirsh等人,1996年)。magainin 2對兩種膜的這些不同影響可能是由于1)通過與肽的帶正電基團(tuán)(例如賴氨酸的?氨基)直接接觸使芘熒光猝滅,或2)插入雙層的=-螺旋肽改變熒光團(tuán)的微環(huán)境,與層平面平行,如上所述。然而,在PG存在的情況下,肽的正電荷應(yīng)在與酸性磷脂形成靜電復(fù)合物時(shí)被中和,從而減少由于π-陽離子相互作用導(dǎo)致的芘熒光猝滅。
有趣的是,在存在酸性磷脂的情況下,肌動蛋白/脂質(zhì)的摩爾比(在該摩爾比下,肌動蛋白的初始增量趨于穩(wěn)定)分別為1:21、1:16和1:12.5,對應(yīng)于XPG=0.1、0.2和0.4(圖2A),分別產(chǎn)生1:2、1:3和1:5的肌動蛋白/磷脂化學(xué)計(jì)量比。同時(shí),DPH的初始r增量在magainin/脂質(zhì)摩爾比為~1:30、1:12和1:5時(shí)趨于平穩(wěn)(XPG分別為0.1、0.2和0.4),對應(yīng)于大約1:3、1:2.5和1:2的magainin/PG化學(xué)計(jì)量比(圖3)。據(jù)報(bào)道,在這些肽/脂質(zhì)摩爾比下,magainin可插入含酸性磷脂的膜中(Ludtke等人,1994年)。此外,已經(jīng)證明,雙分子層中magainin的=-螺旋的方向取決于肽與脂質(zhì)的摩爾比,在上述化學(xué)計(jì)量比下,螺旋應(yīng)垂直于膜表面插入,在含PG的膜中形成孔(Ludtke等人,1996)。這些孔不僅由兩親螺旋的極性面組成,而且還由脂質(zhì)的極性頭基組成,內(nèi)外單層通過這些孔襯脂質(zhì)是連續(xù)的。膜中的這種結(jié)構(gòu)可能會降低探針芘部分微環(huán)境的極性,從而提高其量子產(chǎn)率。有趣的是,當(dāng)XPG>0.1時(shí),magainin 2逐漸降低Ie/Im值(圖3 A),這與增強(qiáng)的?;滍樞驕p少脂質(zhì)側(cè)向擴(kuò)散的速率一致。然而,由于magainin 2已經(jīng)在XPG=0.1時(shí)增加了r,Ie/Im沒有變化,我們可以得出結(jié)論,PPDPG探針向微區(qū)富集以及其橫向擴(kuò)散的減少正在發(fā)生。
與magainin 2類似,吲哚青霉素與陰離子和兩性離子囊泡的膜結(jié)合非常不同(圖1b、4和5),與先前的平衡透析研究一致(Ladokhin et al.,1997)。雖然芘熒光的猝滅顯示吲哚肽被分配到SOPC雙層中,但對膜?;滍樞驇缀鯖]有影響(圖5)。相反,吲哚西啶與陰離子膜的相互作用導(dǎo)致脂酰鏈順序增加,明顯表現(xiàn)為DPH熒光各向異性增加,并對XPG呈S形依賴(圖5)。與magainin 2相反,吲哚西丁導(dǎo)致芘單體和準(zhǔn)分子發(fā)射強(qiáng)度顯著平行降低,與脂質(zhì)成分無關(guān),Ie/Im變化較?。▓D4)。相應(yīng)地,吲哚西丁誘導(dǎo)酸性PG富集到微區(qū)。有趣的是,在吲哚西丁/脂質(zhì)摩爾比為1:20以下,芘Im的減少順序?yàn)閄PG=0.40.20.10(圖4a),而在吲哚西丁/脂質(zhì)摩爾比為1:10時(shí),Im的減少對XPG的依賴性相反。這種變化的可能機(jī)制如下。在低肽/脂摩爾比時(shí),吲哚西丁似乎被調(diào)節(jié)到雙層界面(Ladokhin等人,1997),芘標(biāo)記鏈的鏈反轉(zhuǎn)(Holopainen等人,1999)使該部分更接近雙層表面,從而允許其與吲哚西丁的基本殘基接觸。后者通過π-陽離子相互作用導(dǎo)致芘部分的碰撞猝滅。然而,隨著XPG的增加,我們可以預(yù)期PG頭基與吲哚西丁的堿性殘基發(fā)生靜電結(jié)合,從而阻止芘與吲哚西丁的陽離子殘基之間的直接接觸。隨著肽濃度的增加,吲哚肽的膜結(jié)合以協(xié)同方式增強(qiáng),猝滅效率的逆轉(zhuǎn)可能涉及雙分子層中脂肽復(fù)合物的聚集。因此,在酸性含磷脂的膜中,吲哚對芘的猝滅作用較小。當(dāng)吲哚肽的濃度增加到肽/脂比1:10以上時(shí),肽將以高度協(xié)同的方式并入膜的?;渽^(qū)域(Ha等人,2000)(圖9 E),而在中性膜中,肽位于界面(圖9 D)。插入吲哚西丁的量取決于雙層中的XPG,導(dǎo)致吲哚西丁的Trp殘基的猝滅占主導(dǎo)地位,與XPG=0.4時(shí)Im的顯著減少一致(圖4a)。
馬蓋寧2和吲哚西啶對巨脂質(zhì)體的影響
細(xì)胞質(zhì)膜通透性被認(rèn)為是馬加寧和吲哚肽等肽的抗菌作用的原因(Matsuzaki,1998,1999;Sitaram和Nagaraj,1999),并提出了幾種機(jī)制模型(綜述見Bechinger,1999)??谆蛲ǖ赖男纬杀徽J(rèn)為會導(dǎo)致跨膜電位的耗散和脂質(zhì)不對稱(Falla等人,1996年;Matsuzaki,1998年,1999年;Sitaram和Nagaraj,1999年)。Magainin 2和吲哚肽應(yīng)按照定義的結(jié)構(gòu)插入脂質(zhì)雙層,與所有疏水氨基酸形成構(gòu)象,形成一個(gè)表面,然后與膜的疏水核心接觸。因此,這些肽的膜插入迫使磷脂酰基鏈分開。這些肽的抗菌作用還可能包括局部相變,如脂肽膠束從雙層分離,或由于插入肽引起膜曲率的局部變化,這可能導(dǎo)致雙層結(jié)構(gòu)的局部坍塌。在分子水平上,這些過程可能是本文報(bào)道的magainin 2和吲哚美辛誘導(dǎo)的巨大囊泡形成的基礎(chǔ)。magainin的裂解活性對靶膜的脂質(zhì)成分高度敏感,該肽優(yōu)先結(jié)合并滲透陰離子脂質(zhì)膜(Matsuzaki等人,1991、1993、1995a、1998)。因此,對微生物致死濃度的馬蓋寧不會裂解哺乳動物細(xì)胞,因?yàn)椴溉閯游锛?xì)胞的質(zhì)膜外層不含帶負(fù)電的磷脂(Ma tsuzaki,1999)。大腸桿菌暴露于magainin會導(dǎo)致細(xì)菌表面出現(xiàn)氣泡(Matsuzaki等人,1997年)。在本研究中,觀察到由馬蓋寧2和吲哚青霉素誘導(dǎo)的巨大脂質(zhì)體的囊泡形成,這代表了它們與脂質(zhì)雙層結(jié)合的更宏觀的變化。重要的是,酸性PG的存在是兩種肽產(chǎn)生囊泡所必需的。巨大脂質(zhì)體的囊泡形成需要反復(fù)應(yīng)用magainin 2,因此暗示了一種濃度依賴性作用機(jī)制。已經(jīng)證明,在存在magainin的情況下形成的孔隙是短暫的,具有有限的壽命(Matsuzaki等人,1995b)。當(dāng)附近的孔隙崩解時(shí),可能形成肽和脂質(zhì)的超分子復(fù)合物,從而導(dǎo)致雙層的短暫破壞(圖6)。同時(shí),一些肽分子應(yīng)該轉(zhuǎn)移到膜的內(nèi)部小葉中(Matsuzaki等人,1995a,1996),從而使膜重組和愈合。由于magainin 2而形成的內(nèi)吞小泡比胞吐更明顯(圖6),這可能與肽在雙層外表面的不對稱應(yīng)用有關(guān)。因此,巨大脂質(zhì)體的囊泡化可以緩解由于不對稱肽結(jié)合和隨后的膜膨脹而導(dǎo)致的雙層不利應(yīng)變。囊泡化可以降低剩余巨大脂質(zhì)體膜中的肽濃度,從而減少孔隙形成。隨后,需要繼續(xù)向膜中添加magainin 2以引起巨大脂質(zhì)體的進(jìn)一步囊泡化(圖6)。
吲哚西丁只含有13個(gè)氨基酸,因此太短,無法跨越雙層。然而,該肽可以作為聚集物或帶有相關(guān)酸性磷脂的頭尾二聚體橫跨雙層(圖9 E),從而導(dǎo)致膜不穩(wěn)定性。已經(jīng)證明,吲哚西丁能夠通過穿過外膜殺死革蘭氏陰性細(xì)菌,并通過形成通道破壞細(xì)胞質(zhì)膜(Falla et al.,1996)。與magainin 2的作用相比,吲哚青霉素誘導(dǎo)的內(nèi)吞小泡較?。▓D7)可能反映了這些肽與脂質(zhì)相互作用的不同模式。一些吲哚肽分子可能會轉(zhuǎn)移到膜的內(nèi)部小葉中。除了具有廣譜的抗真菌和抗菌活性外,吲哚西丁對哺乳動物細(xì)胞也有毒性(Schluesener等人,1993年;Ahmad等人,1995年)。有趣的是,吲哚西丁對SOPC和SOPC膽固醇巨型脂質(zhì)體的作用不同。在這一階段,根本原因尚不確定,可能與膽固醇對雙層結(jié)構(gòu)以及吲哚肽在膜中的取向的影響有關(guān)。因此,需要進(jìn)一步的研究來闡明膽固醇對吲哚肽膜結(jié)合的影響。
我們的結(jié)果表明,在帶負(fù)電荷的磷脂存在下,magainin 2對所用生物膜模型的作用顯著增強(qiáng)。除了膜負(fù)電荷外,肽/脂質(zhì)的化學(xué)計(jì)量也被證明是雙層中馬蓋寧組織的重要決定因素(Ludtke等人,1994)。在低肽/脂質(zhì)比率下,=-螺旋肽基本上平行于膜表面,并淺穿透膜的疏水核心(Bechinger等人,1993年;Matsuzaki等人,1994年)。該位置將脂質(zhì)頭基推到一邊,迫使疏水區(qū)域形成間隙,而膜變薄以填充間隙(Ludtke et al.,1995)。先前已強(qiáng)調(diào)了由magainin形成的孔隙的瞬時(shí)性質(zhì)(Matsuzaki等人,1995b)。膜的局部和瞬時(shí)破壞可能需要肽與靶細(xì)胞膜的不對稱結(jié)合。因此,在magainin與靶細(xì)胞質(zhì)膜雙層的外小葉結(jié)合后,該外單分子層的側(cè)壓力比內(nèi)小葉增加。此外,平行于層平面的=-螺旋的表面位置在外層單層中施加曲率應(yīng)變,導(dǎo)致正的自發(fā)曲率。當(dāng)兩個(gè)小葉之間的側(cè)壓差大小和與正自發(fā)曲率相關(guān)的能量超過膜變形所需的能量時(shí),雙分子層不穩(wěn)定,肽相對于層平面的垂直方向發(fā)生重新定向,孔隙打開。這些孔隨后可能在靶體內(nèi)聚集成超分子結(jié)構(gòu),如在巨型脂質(zhì)體中觀察到的(圖6)。因此,孔隙和不穩(wěn)定狀態(tài)將是暫時(shí)的,允許雙層愈合。為此,馬格蛋白2在其序列的中間含有一組正電荷。同樣,當(dāng)該肽在雙層中形成瞬時(shí)孔并垂直于膜平面定向時(shí),這些陽離子殘基也可能靜電結(jié)合到PG,類似于此處提出的吲哚肽組織(圖9)。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的主要區(qū)別在于后者富含膽固醇(Op den Kamp,1979)。上述機(jī)制也將與膽固醇的存在相兼容,以防止magainin 2的膜擾動作用。更具體地說,膽固醇在人類質(zhì)膜的兩個(gè)小葉之間轉(zhuǎn)移(觸發(fā)器)非??欤↙ange et al.,1981)。因此,這種膽固醇的快速易位可以消除在magainin 2結(jié)合到后一單層后靶膜內(nèi)外小葉側(cè)壓力的差異。因此,與細(xì)菌靶點(diǎn)相比,這種肽在真核細(xì)胞中產(chǎn)生毒性作用需要大量的magainin 2(Zasloff,1987)。據(jù)估計(jì),真核細(xì)胞質(zhì)膜外小葉的平衡側(cè)壓力約為32 mN/m(Demel等人,1975年)。在超過34 mN/m的壓力下,觀察到吲哚西丁高效滲透到單層中,這可能部分解釋了該肽在真核細(xì)胞中的溶解作用。此外,哺乳動物質(zhì)膜的外小葉僅由兩性離子磷脂組成,而細(xì)菌膜含有大量帶負(fù)電的PG(Op den Kamp,1979)。因此,由于缺乏負(fù)電荷和高壓,預(yù)計(jì)magainin 2與真核細(xì)胞質(zhì)膜的相互作用較弱,而更有效的插入吲哚肽將能夠干擾真核細(xì)胞雙層的組織。因此,脂質(zhì)特異性可能導(dǎo)致這兩種肽的不同毒性。
結(jié)論
由于抗菌肽的詳細(xì)作用機(jī)制尚待闡明,比較兩種結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的肽吲哚肽和馬蓋寧2對模型生物膜的影響很有意義。盡管它們的構(gòu)象不同,且前者的長度約為后者的一半,但它們也具有諸如凈正電荷和兩親性等特征,導(dǎo)致它們與磷脂膜結(jié)合。酸性磷脂進(jìn)一步增強(qiáng)了這種相互作用,這可能對它們的抗菌活性很重要。酸性磷脂是這些肽囊泡形成巨大脂質(zhì)體所必需的,它們都會導(dǎo)致酸性磷脂分離,將它們絡(luò)合成超分子簇。同樣,這兩種肽都增加了酰基鏈順序。所有這些作用都與抗菌作用所必需的協(xié)同膜結(jié)合相一致,可能涉及肽的瞬時(shí)跨膜定向。還可能是,它們的抗菌作用需要目標(biāo)膜最初不對稱地暴露于這些肽中,并與系統(tǒng)放松回到熱力學(xué)平衡有關(guān)。