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人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——實驗部分
來源:上海謂載 瀏覽 1407 次 發(fā)布時間:2021-11-29
2. 實驗部分
2.1. 材料
純重組人胰島素、甲醇、氯仿和鹽酸從MP Biomedical,LLC(Solon,OH)獲得。 重組人胰島素(Catalog#199744,99.3%分析)已在大腸桿菌表達系統(tǒng)中產生,并使用親和純化進行純化。 所有化學品均為試劑級,使用時無需進一步純化。 用于子階段制備的水來自Modulab 2020水凈化系統(tǒng)(德克薩斯州圣安東尼奧大陸水系統(tǒng)公司)。 純化水的表面張力為72.6 mN·m ? 1在20.0±0.5°C,電阻率為18 MΩ·cm,pH值為5.6時。
2.2. 方法
FITC人胰島素結合程序。 通過FITC-HI的表觀熒光檢測HI-Langmuir單層的形貌。 由于胰島素是非熒光的,所以必須附加一個熒光團才能使用熒光顯微鏡。 常用的蛋白質探針是異硫氰酸熒光素(FITC)。
FITC共軛HI的制備方法如下。 在PBS溶液中分別制備FITC(1 mg/mL)和HI(0.3 mg/mL)溶液。 用鋁箔覆蓋FITC溶液和任何含有FITC的溶液,以防止熒光探針的光降解。 將FITC溶液逐滴加入胰島素溶液中并攪拌1小時。 這兩種溶液在FITC與胰島素的摩爾比為0.5:1至4:1的范圍內相互混合。 攪拌后,溶液通過G-25 Sephadex柱(球狀蛋白范圍:1×103至5×103 Da)按以下順序按重量分離:FITC-HI、HI和FITC。 當流經葡聚糖凝膠柱的其中一種組分的質量高于該范圍時,這些組分將首先流出。 G-25葡聚糖凝膠的最大范圍為5000da; 然而,HI的摩爾質量為5870 g mol ? 1. 三個組成部分中有兩個高于5000 Da,即HI-FITC和HI。 因此,最重的組分HI-FITC將首先流出色譜柱,然后流出HI。 最輕的成分是FITC和FITC碎片,它們保留在柱的頂部,如柱頂部的亮綠色發(fā)光所示。 柱上的紫外光顯示三個不同區(qū)域:柱底部附近的熒光綠色區(qū)域,對應于FITC-HI,其上方的非熒光部分對應于未共軛于FITC的HI,以及柱頂部的熒光黃色區(qū)域,對應于未共軛于HI的FITC。 使用PBS緩沖液運行色譜柱,收集體積為1mL的等分試樣。
熒光光譜法用于選擇含有FITC-HI的小份樣品。 FITC探針在494nm激發(fā)時顯示出517nm的發(fā)射。 人們注意到,當探針與HI共軛時,F(xiàn)ITC發(fā)射的強度增加。 吸收光譜法用于確定HI與FITC的比率,該比率由下式計算得出。21
其中MolWtHI=5870 g mol ? 1和ε280,HI和ε495,F(xiàn)ITC分別為17335和90000。 A495和A280分別是共軛物和HI在494和280 nm處的吸光度。 考慮到FITC在280 nm處的吸光度,校正系數(shù)為0.35×A495。 制備了各種共軛物(FITC x-HI),x代表每HI結合的FITC分子的平均數(shù)量。 一個已經準備好了1個 ? 10個FITC分子與HI分子相連,但具有1個FITC分子的HI共軛物主要用于表觀熒光顯微鏡實驗。
朗繆爾單層制備。 Langmuir單層實驗中使用的HI溶液濃度為0.30 mg/mL,通過將HI粉末溶解在鹽酸水溶液(pH 2)中制備。 對于作為朗繆爾單層進行的所有實驗,亞相(純水)的pH值為5.6。 Kibron槽和KSV槽的鋪展液體積分別為80和40μL。 HI溶液在空氣中擴散 ? 水界面,使用100μL注射器(Hamilton Co.,Reno,Nevada),在亞相表面均勻沉積小液滴,然后等待15分鐘,以使Langmuir單層達到平衡。 壓縮率設定為10mm·min ? 1. 所有等溫線和原位紫外光譜 ? 在溫度(20.0±0.5℃)和濕度(50±1%)保持恒定的潔凈室(1000級)中進行可見光、熒光和輻照光譜測量。
表面化學和光譜學方法。 使用面積為5.9 cm×21.1 cm的Kibronμ-槽(Kibron Inc.,芬蘭赫爾辛基)測量表面壓力 ? 面積(π) ? A) 等溫線 ? 減壓周期和穩(wěn)定性研究。 表面電位 ? 面積(ΔV ? A) 使用由電容式系統(tǒng)組成的開爾文探針在Kibron槽上獲得等溫線。 振動板設置在朗繆爾單層表面上方約1 mm處,鍍金槽底座用作對電極。
空氣中的光譜測量 ? 使用HP 8452 A型紫外分光光度計獲得水界面 ? vis和Fluorog-3熒光分光光度計(Horiba Scientific,愛迪生,新澤西州)用于熒光。 HI-Langmuir單層膜在空氣中的熒光光譜 ? 使用面積為0.25 cm2的分叉光纖測量水界面,并將其放置在亞相表面上方1 mm處。 激發(fā)光通過光纖從光源傳輸?shù)嚼士姞枂螌幽?,朗繆爾單層膜的發(fā)射光通過光纖傳回檢測器。 紫外線 ? 在Perkin Elmer Lambda 900 UV/vis/NIR光譜儀(Norwalk,CT)和Fluorog-3熒光光譜儀(與用于Langmuir單層的熒光光譜儀相同)上分別使用1 cm光程長度的石英反應杯記錄水溶液的可見吸收光譜和熒光光譜。
表觀熒光顯微鏡用于觀察Langmuir單層(如有)中區(qū)域的形成。 顯微鏡需要在樣品臺頂部放置朗繆爾槽。 石英窗允許激發(fā)光穿透亞相,以便在空氣中激發(fā)熒光團 ? 水界面。 實驗裝置使用Kibronμ-槽(Kibron Inc.,芬蘭赫爾辛基)和熒光顯微鏡(Olympus IX-FLA)相結合。 可用于鋪展溶液的面積為5.9 cm×21.1 cm。 該熒光圖像由熱電冷卻光電Magnafire CCD相機拍攝。
布魯斯特角顯微鏡(BAM)用于觀察朗繆爾單層的形貌。 使用IElli-2000成像橢偏儀在關閉補償器和BAM2plus軟件的情況下進行測量。 IElli2000系統(tǒng)的標準激光器是倍頻Nd:YAG激光器(50 mW輸出),使用532 nm線。
使用JASCO J-810分光旋光儀獲得圓二色性(CD)光譜。 在25°C下,使用2.0 mm光程長度的石英電池,在195和250 nm之間記錄光譜。
水溶液的紅外光譜是使用衰減總反射率獲得的。 使用生物ATR輔助裝置,將水樣沉積在ATR晶體表面,很容易獲得紅外光譜。 靜態(tài)模式只需要15分鐘 ? 20μL水溶液; 但是,水溶液的濃度應大于0.5 mg/mL,以確保與ATR晶體適當接觸。 水銀 ? 鎘 ? 碲化物(MCT)探測器(Kolmar Technologies)的掃描速度為5 kHz。 背景光譜為純水。 將生物ATR細胞II置于Bruker Optics Equinox55 FTIR的細胞室中。
紅外反射 ? 使用EQUINOX-55傅里葉變換紅外(FTIR)光譜儀(Bruker Optics,Billerica,MA)對Langmuir單層進行吸收光譜(IRRAS)測量,該光譜儀配備適用于空氣的XA-511外部反射附件 ? 水界面實驗。 紅外光束聚焦在空中 ? Kibronμ-槽的水界面。 反射的紅外光束進入了由液氮冷卻的HgCdTe(MCT)探測器。 獲得的光譜分辨率為8 cm ? 1通過對1200個p極化掃描和800個s極化掃描的疊加。
人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——摘要、介紹
人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——實驗部分
人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——結果和討論
人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——結論、致謝!