細(xì)胞膜是由蛋白質(zhì)與膽固醇等分子鑲嵌在磷脂中的典型雙分子層結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜仿生技術(shù)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)在納米顆粒以及納米液滴表面修飾組裝，并實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的長循環(huán)以及良好生物相容性。典型的細(xì)胞膜仿生技術(shù)是將剝離后的細(xì)胞膜直接以磷脂雙分子層的形式包被于納米顆?；蛞旱伪砻?。然而由于表面張力作用，細(xì)胞膜的磷脂雙分子層無法直接包被在微米級的氣泡表面。

本發(fā)明采用反復(fù)液氮冷凍-室溫融化的方式向血小板膜中摻雜磷脂并得到血小板膜凍融復(fù)合物囊泡。通過Langmuir-Blodgett膜天平測試得到凍融復(fù)合物中的磷脂蛋白質(zhì)分子在氣液界面的表面張力顯著降低，通過差適量熱掃描技術(shù)測試表明摻雜后的血小板膜玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度降低。利用超聲輔助的方式向血小板膜凍融復(fù)合物囊泡中鼓入六氟化硫氣體，在氣液界面形成血小板膜凍融復(fù)合物微泡。通過熒光標(biāo)記的方式定位血小板膜蛋白，并成功示蹤其融合在血小板膜凍融復(fù)合物微泡。通過對血小板膜凍融復(fù)合物囊泡以及血小板膜凍融復(fù)合物微泡進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)血小板膜凍融復(fù)合物微泡繼承了血小板膜凍融復(fù)合物囊泡61.4%的蛋白質(zhì)種類，并維持了血小板膜表面的整合素αIIβ3活化的構(gòu)象。在大鼠下腔靜脈急慢性血栓模型實(shí)驗(yàn)中，血小板膜凍融復(fù)合物微泡能夠特異性識別急性血栓，其對于急性血栓診斷平均信噪比為12.47 dB，而慢性血栓為0.1dB。

細(xì)胞膜表面張力調(diào)控方法示意圖；

不同磷脂配方的脂質(zhì)體對氣液界面表面張力調(diào)控效應(yīng)的表面壓力與面積等溫曲線圖；

不同蛋白質(zhì)與磷脂質(zhì)量比對氣液界面表面張力調(diào)控效應(yīng)圖：A為牛血清白蛋白與磷脂在氣液界面組裝的示意圖；B為不同蛋白質(zhì)與磷脂質(zhì)量比的氣液界面表面壓力與面積等溫曲線圖；C為不同蛋白質(zhì)與磷脂質(zhì)量比的表面張力值；

實(shí)施例：

1、血小板膜的提?。?

首先從人、大鼠、小鼠、兔、牛、豬的全血中選取血小板，所選的磷脂為二棕櫚酸磷脂酰膽堿、二硬脂酸磷脂酰乙胺醇-聚乙二醇2000、硬脂酸、二硬脂酸磷脂甘油的組合；然后，在全血提取出的血小板中，加入終濃度為42 mM的甘露糖、終濃度為1μM的前列腺素E1，和磷酸酶蛋白酶抑制劑混合物，得到濃度為2×108

個/mL的血小板懸液。將血小板懸液在-80°C冰箱中冷凍1小時，隨后在37°C恒溫水浴箱中融化，反復(fù)三次后于4°C，12000g條件下離心15分鐘得到血小板膜懸液，并用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度，用磷脂試劑盒定量磷脂濃度。

2、磷脂的制備：

磷脂按照二棕櫚酸磷脂酰膽堿、二硬脂酸磷脂酰乙胺醇-聚乙二醇2000、硬脂酸、二硬脂酸磷脂甘油的以一系列質(zhì)量比例溶解在體積比為1：1的氯仿和甲醇中，于50℃，100rpm的條件下旋蒸直到圓底燒瓶底部出現(xiàn)一層均勻的薄膜，取下燒瓶，真空干燥8小時。往干燥后的燒瓶中加入磷酸緩沖液并在50℃、100 w、53 kHZ的條件下水浴超聲得到脂質(zhì)體膜溶液，并調(diào)節(jié)脂質(zhì)體膜溶液的PH為7.4。將血小板膜與脂質(zhì)體在不同的蛋白質(zhì)磷脂質(zhì)量比例下進(jìn)行混合。將混合物在液氮和室溫下反復(fù)凍融6次得到血小板膜凍融復(fù)合物。將血小板膜或血小板膜凍融復(fù)合物轉(zhuǎn)移到置于冰上的10 mL玻璃瓶中，將六氟化硫氣體吹入系統(tǒng)，用探針超聲處理（300 W，5 s開/5 s關(guān)）將六氟化硫氣體分散到水性介質(zhì)中4個循環(huán)分別得到血小板膜納泡以及血小板膜凍融復(fù)合物微泡。

3、蛋白質(zhì)磷脂復(fù)合物氣液界面張力調(diào)控：

采用Langmuir-Blodgett多功能膜天平測量所制備磷脂復(fù)合物在氣液界面處的表面張力。用微量注射器將20μL磷脂（1mg/mL脂濃度）氯仿溶液涂在Langmuir-Blodgett多功能膜天平上，使氯仿蒸發(fā)10分鐘。將表面的初始面積設(shè)置為282 cm2

，并在20℃下以10 mm/min的速率壓縮薄膜，記錄表面張力-表面積曲線。如圖2所示在一系列磷脂配方中，DSPE-PEG2000

的摩爾百分比為10%時在氣液界面具有最低的表面張力（3mN/m），DPPC：DPPG：DSPE-PEG2000

的比例為8：1：1的時候氣液界面的的表面壓力達(dá)到69mN/m，因此具有最低的氣液界面表面張力（2mN/m）。為了探究蛋白質(zhì)與磷脂在氣液界面組裝的規(guī)律，如圖3中的A所示，選用牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配置好一系列不同蛋白質(zhì)與磷脂質(zhì)量比的磷脂蛋白質(zhì)復(fù)合物，并用微量注射器將20μL磷脂蛋白質(zhì)復(fù)合物（1mg/mL脂濃度）氯仿溶液涂在Langmuir-Blodgett多功能膜天平上，使氯仿蒸發(fā)10分鐘。將表面的初始面積設(shè)置為282cm2

，并在20℃下以10 mm/min的速率壓縮薄膜，記錄表面張力-表面積曲線。如圖3中的B以及C所示在一系列具有不同質(zhì)量比的磷脂蛋白質(zhì)復(fù)合物中當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)比磷脂的質(zhì)量比為0.02時具有最低的氣液界面表面張力。

4、血小板膜-磷脂融合驗(yàn)證：

分別用過量的DiO和DiI對血小板膜囊泡和脂質(zhì)體進(jìn)行染色，隨后用12000 g，15min，4℃的條件去除未嵌膜的染料。按照不同蛋白質(zhì)：磷脂質(zhì)量比添加兩種膜材并在37℃恒溫箱中共孵育30分鐘，取出后在液氮中放置1分鐘，隨后放置于37℃融化，重復(fù)該循環(huán)5次。凍融循環(huán)后的凍融復(fù)合物溶液置于冰上，用功率為10 w，頻率為25 Khz的探頭超聲，控制超聲5秒開時間，5秒關(guān)時間，總時間為2分鐘，得到熒光標(biāo)記血小板膜凍融復(fù)合物囊泡。在3 ml的石英比色皿加入2 ml水和20 ul樣品，用460 nm波長的激光作為激發(fā)光，接收480-680 nm的發(fā)射光。如圖4中的A所示由于DiI與DiO分子在距離小于10 nm時會發(fā)生Foster熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）現(xiàn)象，嵌在磷脂雙分子層中疏水端的分子彼此接近且小于10nm可以證明血小板膜與脂質(zhì)體的磷脂進(jìn)行了相互的融合。如圖4中的B所示，隨著蛋白質(zhì)與磷脂的質(zhì)量比降低熒光共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象逐漸明顯，說明膜融合的程度增大。分別用過量的DiO和DiD對血小板膜囊泡和脂質(zhì)體進(jìn)行染色，隨后用12000 g，15 min，4℃的條件去除未嵌膜的染料。將染色后的血小板囊泡以及脂質(zhì)體在蛋白質(zhì)與磷脂的質(zhì)量比為0.02時分別通過混合孵育以及凍融兩種方式進(jìn)行融合，通過流式細(xì)胞術(shù)來觀察兩者融合效率，如圖4中的C所示，當(dāng)血小板囊泡與脂質(zhì)體形成凍融復(fù)合物可以有效融合兩種組分。取不同膜蛋白：脂質(zhì)體的質(zhì)量比的血小板膜凍融復(fù)合物微泡進(jìn)行凍干，凍干粉進(jìn)行差示量熱掃描分析，掃描速度為5℃/min。如圖5所示，隨著摻雜磷脂的比例增加，血小板膜凍融復(fù)合物的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度降低，在蛋白質(zhì)與磷脂的質(zhì)量比為0.02時候具有最低的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度。血小板膜氣液界面張力調(diào)控。使用凍融的方法向血小板膜中摻雜不同比例的磷脂，形成凍融復(fù)合物，其組分的構(gòu)成如圖6所示。向血小板膜中摻雜不同比例的磷脂，形成的血小板膜凍融復(fù)合物在氣液界面的表面張力隨著蛋白質(zhì)與磷脂質(zhì)量比的降低而降低，如圖7所示血小板膜凍融復(fù)合物在蛋白質(zhì)與磷脂的質(zhì)量比為0.02時具有最低的氣液界面表面張力。

5、血小板膜氣液界面組裝組分的定位：

血小板膜用Cy5.5進(jìn)行蛋白標(biāo)記，用于在氣液界面組裝過程中進(jìn)行組分定位。將血小板膜、血小板膜凍融復(fù)合物或血小板膜和脂質(zhì)體的混合物在SF6

氣氛中超聲乳化。得到的氣泡用于流式細(xì)胞術(shù)分析，在FSC/SSC門控中分離所得氣泡，并定量Q2和Q4區(qū)域的Cy5.5熒光，如圖8所示，相對于血小板膜與脂質(zhì)體的混合物使用血小板膜凍融復(fù)合物可以有效將血小板膜組分組裝在微米氣泡上。對于熒光定位分析，用Cy5.5標(biāo)記血小板膜組分進(jìn)行定向。將所有囊泡系統(tǒng)在超聲處理前以12000g離心10分鐘，超聲處理后以50g離心10分鐘，并通過小動物體內(nèi)成像系統(tǒng)（IVIS）成像以檢測Cy5.5信號。超聲處理后，通過Zetasizer測量原始混合物和離心管中頂部或向下部分的粒徑。如圖9所示，使用血小板膜凍融復(fù)合物制備的微泡中檢測到標(biāo)記血小板膜的熒光分子Cy5.5。

6、制備過程產(chǎn)物形貌及電位表征：

采用透射電子顯微鏡對血小板膜、血小板膜凍融復(fù)合物、血小板膜納泡和血小板膜凍融復(fù)合物微泡的形貌進(jìn)行表征。將所有樣品稀釋至0.1 mg/mL（脂質(zhì)濃度）。將10μL的血小板膜和血小板膜凍融復(fù)合物滴落到碳涂層銅網(wǎng)上。真空干燥15分鐘后，用1%醋酸鈾對樣品進(jìn)行負(fù)染。將10μL的PNBs和PMBs在室溫下滴落在碳包覆的銅網(wǎng)格上2 h，使其吸附到碳膜表面。使用透射電子顯微鏡在100 kV的加速電壓下檢查所有樣品。如圖10所示，血小板膜（A）與血小板膜（C）具有典型的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，而在血小板膜納米泡（B）以及血小板膜凍融復(fù)合物微泡（D）具有典型的單分子層氣泡結(jié)構(gòu)。通過Zetasizer測量血小板膜、血小板膜凍融復(fù)合物、血小板膜納泡和血小板膜凍融復(fù)合物微泡的水合粒徑和zeta電位，如圖11所示，血小板膜與血小板膜納泡具有相似的zeta電位，在摻雜磷脂后血小板膜凍融復(fù)合物以及血小板膜凍融復(fù)合物微泡的zeta電位有明顯降低降低為-47mV。

7、血小板膜凍融復(fù)合物微泡蛋白表征：

對制備的血小板膜凍融復(fù)合物與血小板膜凍融復(fù)合物微泡進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，如圖12所示，血小板膜凍融復(fù)合物微泡繼承了血小板膜凍融復(fù)合物61.7%的蛋白質(zhì)種類。將制備的血小板膜凍融復(fù)合物微泡與FITC標(biāo)記的CD41抗體先渦旋混合2分鐘，再放于37°C中緩慢攪拌孵育30分鐘。平行組再用膜染料DiI非特異性地染磷脂，取出后在200g，2分鐘的離心條件將微氣泡與未結(jié)合的抗體分離。取微氣泡稀釋20倍后滴于帶有凹槽的載玻片中，再蓋上蓋玻片，分別用484nm和559nm的激發(fā)光源拍攝共聚焦顯微鏡。如圖13所示，在血小板膜凍融復(fù)合物微泡中來自血小板膜的綠色熒光與來自脂質(zhì)體的紅色熒光有效共定位。

8、血小板膜凍融復(fù)合物微泡糖蛋白αIIbβ3蛋白質(zhì)構(gòu)象分析：

收集的血小板靜置在Tyrode緩沖液中（5×105

）。將血小板或血小板膜凍融復(fù)合物微泡與生理鹽水或凝血酶（0.5 U/mL）在200μL終體積的Tyrode緩沖液中孵育15分鐘。然后用10μL PE-JON/A抗體在室溫下黑暗染色20 min，并在進(jìn)行流式分析。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中用0.5 U/mL凝血酶刺激小鼠血小板，加入裂解緩沖液終止反應(yīng)。然后將活化的血小板裂解物、血小板裂解物、血小板膜凍融復(fù)合物裂解物和血小板膜凍融復(fù)合物微泡裂解物與抗β3抗體（50μg/mL）在4°C下孵育過夜。次日加入rProtein A/G磁珠吸收免疫復(fù)合物。將樣品在磁架上分離，并用裂解緩沖液洗滌6次。使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和含有β3和talin-1抗體的蛋白質(zhì)印跡分析免疫沉淀。如圖14所示，血小板膜凍融復(fù)合物微泡表面的糖蛋白αIIbβ3具有活化的構(gòu)象，并且其活化不依賴血小板內(nèi)的Talin-1蛋白。

9、急慢性血栓模型的構(gòu)建：

用異氟烷麻醉大鼠，開腹后找到下腔靜脈，并用一段長為4 mm，寬為2 mm的濾紙條泡在20%的三氯化鐵中，取出后貼在下腔靜脈表面，1分鐘后取走濾紙條，并用PBS重洗該處，構(gòu)建大鼠急性血栓模型。在慢性血栓模型中，大鼠的傷口縫合后在無菌環(huán)境下飼養(yǎng)10天，構(gòu)建慢性血栓模型。

10、急慢性血栓模型的超聲分子影像診斷：

超聲造影設(shè)備采用GE公司生產(chǎn)的LOGIQ E9型全身應(yīng)用超高端彩超，首先選用18MHz探頭機(jī)械指數(shù)MI調(diào)節(jié)為1.0，在B模式下對下腔靜脈進(jìn)行造影，對血栓的大小及位置進(jìn)行判斷，在多普勒模式下對血栓處的血流進(jìn)行造影。用5 ml注射器抽取5 ml生理鹽水加入到血小板膜凍融復(fù)合物微氣泡凍干粉中，用力震蕩復(fù)溶形成血小板膜凍融復(fù)合物微氣泡。將血小板膜凍融復(fù)合物微氣泡通過尾靜脈分別注射入大鼠的尾靜脈中。再選用9 MHz的探頭，機(jī)械指數(shù)MI調(diào)節(jié)為0.14，在對比增強(qiáng)模式（CEUS）下對下腔靜脈進(jìn)行造影，血管灌注及血栓靶向時的對比增強(qiáng)超聲圖像分析。連續(xù)采集5分鐘內(nèi)的圖像，并使用MATLAB軟件對圖像感興趣區(qū)域的信號強(qiáng)度進(jìn)行分析，并根據(jù)超聲強(qiáng)度的標(biāo)尺來確定感興趣區(qū)域的超聲信號值。如圖15所示，在急性血栓模型中，血小板膜凍融復(fù)合物微泡能夠有效靶向急性血栓，因此有效低提高急性血栓診斷的超聲信噪比。如圖16所示，在慢性血栓模型中，血小板膜凍融復(fù)合物微泡在慢性血栓處無富集，其超聲信噪比沒有顯著變化。通過對急性血栓以及慢性血栓進(jìn)行蘇木精-伊紅以及馬松染色分析證明二者組分有明顯差異，在急性血栓中以纖維蛋白為主而在慢性血栓中以膠原為主，血小板膜凍融復(fù)合物微泡在二者診斷中的平均超聲信噪比有顯著性差異。

綜上所述，本發(fā)明采用反復(fù)液氮冷凍-室溫融化的方式向血小板膜中摻雜磷脂并得到血小板膜凍融復(fù)合物囊泡。通過Langmuir-Blodgett膜天平測試得到凍融復(fù)合物中的磷脂蛋白質(zhì)分子在氣液界面的表面張力顯著降低，通過差適量熱掃描技術(shù)測試表明摻雜后的血小板膜玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度降低。利用超聲輔助的方式向血小板膜凍融復(fù)合物囊泡中鼓入六氟化硫氣體，在氣液界面形成血小板膜凍融復(fù)合物微泡。通過熒光標(biāo)記的方式定位血小板膜蛋白，并成功示蹤其融合在血小板膜凍融復(fù)合物微泡。通過對血小板膜凍融復(fù)合物囊泡以及血小板膜凍融復(fù)合物微泡進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)血小板膜凍融復(fù)合物微泡繼承了血小板膜凍融復(fù)合物囊泡61.4%的蛋白質(zhì)種類，并維持了血小板膜表面的整合素αIIβ3活化的構(gòu)象。在大鼠下腔靜脈急慢性血栓模型實(shí)驗(yàn)中，血小板膜凍融復(fù)合物微泡能夠特異性識別急性血栓，其對于急性血栓診斷平均信噪比為12.47 dB，而慢性血栓為0.1dB。