結(jié)果和討論

首先，給出了從表面壓力測(cè)量中獲得的壓縮等溫線，揭示了水、鈉和鈣溶液中脂質(zhì)單層之間的宏觀差異。然后，我們使用熒光顯微鏡沿著壓縮等溫線觀察了結(jié)構(gòu)域的形成，并跟蹤了當(dāng)Ca2+離子結(jié)合到單層時(shí)結(jié)構(gòu)域的變化。最后，利用VSFG在分子水平上闡明了陽(yáng)離子-脂質(zhì)相互作用。

壓縮等溫線。圖2顯示了DPPC和DMPS單分子膜在不同亞相（凈水、1 M NaCl和1 M CaCl2溶液）上的Langmuir等溫線。對(duì)于此處使用的1 M NaCl和1 M CaCl2溶液，亞相中的氯離子濃度不同。由于氯離子與磷脂的配位作用較弱，因此可以忽略因氯離子濃度不同而產(chǎn)生的11種可能影響，這已通過(guò)使用0.5 M CaCl2溶液的對(duì)照實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。

圖2：DPPC（A）和DMPS（b）在不同亞相上的壓力面積（π-A）等溫線：凈水（藍(lán)色）、1 M NaCl溶液（綠色）、1 M CaCl2溶液（紅色）。沿等溫線顯示了液相膨脹相（LE）、液相凝聚相（LC）和兩相共存區(qū)（LE+LC）。ACa2+代表鈣離子的面積。

在水上，DPPC的相行為已被充分記錄。23,25隨著表面積的減小，已確定以下區(qū)域：氣相、液相膨脹（LE）相、LE和液相冷凝（LC）相共存的平臺(tái)特征以及純LC相。

由于亞相中存在鈉離子，DPPC的壓縮等溫線在LE和LE+LC區(qū)域移動(dòng)到略高的表面壓力。之前也觀察到了同樣的效果30，這可以通過(guò)離子結(jié)合到LE相引起的脂鏈紊亂來(lái)解釋。在較高的表面壓力下，鈉對(duì)壓縮等溫線沒(méi)有影響，表明鈉離子與LC相沒(méi)有明顯的相互作用：離子可能正從頭群區(qū)域“擠出”。

對(duì)于CaCl2溶液亞相，觀察到更顯著的效果。在這里，表面壓力在低得多的密度下變得有限(～140?2/分子），而從LE相到LE+LC共存區(qū)的轉(zhuǎn)變不太明顯。在LC區(qū)域（π>20 mN/m），鈣的存在導(dǎo)致脂質(zhì)占據(jù)4?2/m的額外空間，這正是鈣離子的足跡。31這表明，在表面壓力超過(guò)20 mN/m時(shí)，使頭部基團(tuán)水合的水被鈣離子取代。在更高的表面壓力（>25 mN/m）下，額外面積下降約2?2/脂。分子面積差異的變化可以用兩種方式來(lái)解釋?zhuān)海?）從1:1到2:1脂質(zhì)/Ca2+復(fù)合物的轉(zhuǎn)變，正如之前MD模擬所提出的那樣；11（2）脂質(zhì)頭基構(gòu)象的變化。6,23

對(duì)于DMP，水上壓縮等溫線（圖2b）顯示出與DPPC相同的相行為，具有LE、LE+LC和LC區(qū)域。然而，壓縮后，每個(gè)分子可以達(dá)到更小的面積。這表明PS比PC更具可壓縮性，這與相鄰帶電頭基團(tuán)之間的庫(kù)侖排斥作用應(yīng)擴(kuò)大每個(gè)PS分子面積的直觀表示相反。結(jié)果表明，相鄰PS頭基帶電部分的強(qiáng)分子間配位在面積減小中起作用。16

對(duì)于1 M Ca2+溶液上的DMPS單分子膜，與觀察到的純水共存區(qū)的π）10 mN/M壓力相比，LE+LC平臺(tái)壓力降低到π）5 mN/M；在較高的表面壓力（π>20 mN/m）下，兩條等溫線的位移保持等于Ca2+足跡，4?2/脂，未觀察到明顯轉(zhuǎn)變?yōu)?:1脂/Ca2+復(fù)合物。

熒光顯微鏡。利用熒光顯微鏡可以觀察到脂質(zhì)單分子膜內(nèi)的共存相。圖3顯示了三種典型表面壓力下，用熒光探針標(biāo)記的DPPC和DMPS單分子膜沿等溫線獲得的熒光圖像。暗區(qū)對(duì)應(yīng)于有序（LC）疇，亮區(qū)對(duì)應(yīng)于無(wú)序（LE）疇。對(duì)于凈水子相（圖3中的左列），低表面壓力下的LC域?yàn)镈PPC（圖3a）19的“豆”形和DMP的“花”形（圖3d）。隨著表面積的減少，LC域在凝聚成連續(xù)LC相（圖3c）之前通過(guò)有序脂質(zhì)的狹窄區(qū)域相互連接（圖3b）33。從熒光圖像分析中獲得的有序暗區(qū)的歸一化面積Adark（圖4）表明，LC相在單層壓縮后增加，并在π>10 mN/m時(shí)覆蓋整個(gè)單層。

圖3：水上DPPC（a、b、c）和DMPS（d）單層的熒光圖像（左圖）和1 M CaCl2溶液（右圖），π）4 mN/M（a）、π）6.5 mN/M（b）、π）35 mN/M（c）和π）2 mN/M（d）。單分子膜用5 mol%羅丹明PE標(biāo)記：亮區(qū)對(duì)應(yīng)于LE相，暗區(qū)為L(zhǎng)C結(jié)構(gòu)域。比例尺代表15μm。所有圖像的對(duì)比度都相同。

當(dāng)鈣存在于亞相時(shí)，PC和PS單分子膜在低表面壓力下都可以觀察到小的有序疇。更大面積的單層被這些～與水相比，Ca2+的有序疇為3.5μm（見(jiàn)圖4）。因此，低表面壓力下的這些小區(qū)域是鈣誘導(dǎo)的，它們占據(jù)～表面的30%（對(duì)于PC）和20%（對(duì)于PS）。從下面的VSFG測(cè)量中也可以明顯看出這些域的存在。到目前為止，這種鈣離子誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域僅在混合單層系統(tǒng)中觀察到。34,35在中等表面壓力下（5 mN/m<π<25 mN/m），從圖4可以明顯看出，Ca2+的作用是降低有序疇的密度。

圖4：。在凈水（藍(lán)色）和1 M CaCl2溶液（紅色）上，DPPC（a）和DMPS（b）單分子膜的熒光圖像中暗有序LC域的部分面積Adark隨表面壓力的變化。注意周?chē)鷺?biāo)記的局部最大值～在存在Ca2+離子的情況下，兩種脂質(zhì)均為3 mN/m。

振動(dòng)和頻發(fā)生光譜學(xué)（VSFG）。VSFG是一種非線性振動(dòng)光譜技術(shù)，可提供界面分子構(gòu)象順序和方向的表面特定信息，進(jìn)一步研究了在Ca2+存在下這種改變相行為的分子起源。21,22為了量化離子對(duì)脂質(zhì)尾部構(gòu)象的影響，在C-H拉伸區(qū)域收集VSFG光譜。沿等溫線測(cè)量了幾個(gè)表面壓力的光譜；圖5顯示了DPPC單層在20 mN/m和35 mN/m下三種不同亞相的光譜?？梢杂^察到五種振動(dòng)模式：以2876、2970和2938 cm-1為中心的峰值分別歸屬于CH3對(duì)稱(chēng)拉伸、CH3反對(duì)稱(chēng)拉伸和CH3費(fèi)米共振。22 CH2對(duì)稱(chēng)和反對(duì)稱(chēng)拉伸頻率約為2846和2920 cm-1。氘化DPPC脂質(zhì)單層（d62和d75 DPPC）上的VSFG實(shí)驗(yàn)顯示膽堿C-H伸展的信號(hào)非常低。

圖5：。DPPC在π）20 mN/m（頂板）和π）35 mN/m（底板）時(shí)的VSFG光譜。垂直線表示亞甲基對(duì)稱(chēng)拉伸（νsCH2）和甲基對(duì)稱(chēng)拉伸（νsCH3）的位置。所有光譜均歸一化為z切石英的參考信號(hào)。實(shí)線表示使用洛倫茲模型擬合數(shù)據(jù)。

單分子層壓縮后，CH2強(qiáng)度顯著降低。這可以從對(duì)稱(chēng)性參數(shù)中理解：當(dāng)烷基鏈中的亞甲基從順式構(gòu)象變?yōu)榉词綐?gòu)象時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)局部反轉(zhuǎn)中心，從而使CH2模式SFG無(wú)效。23另一方面，CH3強(qiáng)度隨著單層的壓縮而急劇增加，這是由于鏈傾角的角度分布變窄所致。CH3和CH2對(duì)稱(chēng)拉伸振子強(qiáng)度可通過(guò)擬合數(shù)據(jù)獲得?？紤]到前面的論點(diǎn)，CH3和CH2對(duì)稱(chēng)拉伸振子強(qiáng)度的比值R為脂鏈的順序提供了一個(gè)靈敏的經(jīng)驗(yàn)度量。24為了可靠地提取R，使用洛倫茲多峰模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行全局分析（見(jiàn)支持信息中的公式2，實(shí)驗(yàn)部分），僅允許峰值振幅隨表面壓力的變化而變化。DPPC和DMPS的R在圖6中繪制為表面壓力的函數(shù)。

圖6：。作為DPPC（a）和DMPS（b）單分子膜表面壓力的函數(shù)，CH3和CH2對(duì)稱(chēng)拉伸振子強(qiáng)度的比值R：純水（藍(lán)色）、1 M NaCl溶液（綠色）和1 M CaCl2溶液（紅色）。由于單分子膜的崩塌，在π）40 mN/m時(shí)，無(wú)法測(cè)定Na+-DPPC的比值R。由于壓縮單層膜的νsCH2振幅的不確定性，在較高壓力下，誤差條較大。插圖顯示了作為每種脂質(zhì)面積函數(shù)顯示的比率R。請(qǐng)注意～4?2/脂質(zhì)置換（解釋為Ca2+足跡），與圖2中的等溫線一致。

對(duì)于純水和NaCl亞相上的DPPC單分子膜，R隨壓力以類(lèi)似的方式變化，在鈉存在的情況下，R值稍小，但重復(fù)性較小。這表明，正如壓區(qū)等溫線也顯示的那樣，在Na+存在的情況下，DPPC單分子膜的有序性稍差，這與之前關(guān)于亞相中高濃度NaCl的報(bào)告一致，30但與分子動(dòng)力學(xué)模擬不一致，11,13表明在～10 mN/m表面壓力。

對(duì)于含有Ca2+離子的亞相上的DPPC，R在5 mN/m處顯示出一個(gè)小但可重復(fù)的峰值，隨后在10到20 mN/m之間略有下降，然后在25 mN/m左右急劇增加。在低表面張力下，按順序短暫增加(～5 mN/m）與熒光顯微鏡的結(jié)果非常一致，這表明在這些壓力下也會(huì)依次增加（圖6）。在下文中，我們將嘗試使用表面張力測(cè)量、熒光顯微鏡和VSFG測(cè)量的結(jié)果，提供單層相行為的統(tǒng)一圖片。我們將首先討論DPPC的具體結(jié)果，然后討論DMP。

在VSFG測(cè)量中，當(dāng)探測(cè)面積為～10-2 mm2，但隨著單層中平均階數(shù)的增加，R值出現(xiàn)峰值。進(jìn)一步壓縮，誘導(dǎo)域合并成更大的域。同時(shí)，Adark增加，但Ca2+仍比水低20%（圖4a，10 mN/m<π<25 mN/m）。這再次與VSFG光譜很好地一致，VSFG光譜表明這些表面壓力下的脂質(zhì)尾部更加無(wú)序，因?yàn)?0 mN/m的CH2對(duì)稱(chēng)和反對(duì)稱(chēng)拉伸在亞相Ca2+中更加突出（圖5）。

當(dāng)表面壓力達(dá)到25 mN/m時(shí)，R急劇增加，達(dá)到一個(gè)恒定的大值。有趣的是，R的急劇增加與等溫線中脂質(zhì)面積減少2?2/脂質(zhì)的位置一致（見(jiàn)圖2），我們將其歸因于（見(jiàn)上文）從1:1脂質(zhì)/鈣+復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)?:1復(fù)合物。這意味著順序的增加，即R的增加，涉及到由Ca2+-脂質(zhì)相互作用的明顯變化引起的頭群的重新排列。當(dāng)比較Ca2+溶液與純水時(shí)，從R值增加的不同點(diǎn)也可以明顯看出與Ca2+離子足跡相關(guān)的4?2/脂質(zhì)表面積。當(dāng)繪制R與每種脂質(zhì)的面積之比時(shí)，R的增加精確地移動(dòng)了一個(gè)單位的ACa2+（插圖6）。

當(dāng)Ca2+-DPPC體系（π）25 mN/m的比值R急劇增大時(shí)，20%的單層面積仍被LE相覆蓋。從VSFG獲得的比率R的增加并不是由于脂尾中的笨拙缺陷消失，而是由于LC相中的烷基鏈朝向鏈與表面法線之間的較小角度θ重新定向。這可以從νsCH3和甲基反對(duì)稱(chēng)拉伸12的振幅之比得出結(jié)論（詳細(xì)信息見(jiàn)支持信息），這表明DPPC在Ca2+溶液中的θ比在純水中的θ小10°。在這些壓力下，鈣離子的存在導(dǎo)致脂質(zhì)向表面法線協(xié)同傾斜。

對(duì)于DMP，盡管其頭基結(jié)構(gòu)和電荷不同，但Na+和Ca2+離子的結(jié)果與DPPC的結(jié)果非常相似。由于DMPS的非極性烴鏈長(zhǎng)度略短（DMPS為14個(gè)碳，DPPC為16個(gè)碳），與DPPC相比，DMPS壓縮單層的R值較低。先前已經(jīng)報(bào)道了烷基鏈的長(zhǎng)度與單層的相對(duì)順序之間的直接相關(guān)性。36

對(duì)于Ca2+，DMPS單分子膜的比率R與DPPC單分子膜的趨勢(shì)相似：在低表面壓力下出現(xiàn)峰值(～3 mN/m），并且在較高的表面壓力（π）30 mN/m時(shí)會(huì)出現(xiàn)急劇增加，ACa2+開(kāi)始向每個(gè)分子的更高面積方向移動(dòng)（插圖6）。同樣，這與等溫線數(shù)據(jù)和熒光圖像非常一致。對(duì)于高表面壓力（π>30mN/m）下的DMP，發(fā)現(xiàn)R與亞相中鈣的存在無(wú)關(guān)，表明在高壓下存在類(lèi)似的?；溑判?。

可以注意到兩種脂質(zhì)之間的三個(gè)差異：首先，在5 mN/m<π<25 mN/m的區(qū)域，在熒光結(jié)果中，鈣誘導(dǎo)的DPPC下降順序?qū)τ贒MPS是明顯的，但在VSFG結(jié)果中則不太明顯。其次，DPPC中觀察到的從1:1到2:1脂質(zhì)/鈣復(fù)合物的轉(zhuǎn)變對(duì)于DMPS來(lái)說(shuō)并不明顯，盡管ACa2+在熒光和VSFG數(shù)據(jù)中都出現(xiàn)。第三，雖然鈉離子在高壓（π>25 mN/m）下誘導(dǎo)兩種脂質(zhì)紊亂，但這種效應(yīng)對(duì)DMP顯著更大。目前，我們對(duì)這些觀察結(jié)果沒(méi)有一個(gè)令人滿(mǎn)意的解釋?zhuān)瞬町惐仨氃从诩瘓F(tuán)結(jié)構(gòu)的差異。

盡管DPPC和DMPS之間離子脂質(zhì)相互作用的一些細(xì)節(jié)存在這些差異，但很明顯，Ca2+在低表面壓力下誘導(dǎo)兩種脂質(zhì)中有序結(jié)構(gòu)域的形成，在中等表面壓力下誘導(dǎo)無(wú)序結(jié)構(gòu)域的形成（對(duì)于DPPC），在最高表面壓力下誘導(dǎo)高度有序結(jié)構(gòu)域的形成。對(duì)于這兩種脂質(zhì)，觀察到明顯的證據(jù)表明脂質(zhì)和Ca2+之間形成復(fù)合物，但Na+不存在。鈉對(duì)脂質(zhì)單分子膜的影響要小得多，主要是在高表面壓力下引起紊亂（最明顯的是DMP）。在研究頭部附近水分子的方向時(shí)，觀察到兩種脂質(zhì)之間的其他相似性。O-D拉伸振動(dòng)中D2O亞相上DPPC和DMPS的VSFG光譜（未顯示數(shù)據(jù)）表明，水合水分子在陰離子和兩性離子頭基附近以相同的方式取向。這表明PC表現(xiàn)為陰離子脂質(zhì)，因?yàn)镈PPC的頭基與其膽堿基團(tuán)朝向界面。32因此，鈣與PC和PS磷脂的相互作用類(lèi)似并不奇怪，很可能與磷酸鹽部分協(xié)調(diào)。

結(jié)論

綜上所述，我們結(jié)合三種互補(bǔ)技術(shù)來(lái)研究陽(yáng)離子對(duì)PC和PS單分子膜的影響。我們的結(jié)果表明，鈉離子對(duì)DPPC單分子膜的影響很小，主要是擴(kuò)張脂質(zhì)單分子膜。另一方面，鈣有明顯的效果，這在很大程度上取決于表面壓力。在低表面壓力下，鈣離子誘導(dǎo)形成小而有序的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域，隨著表面壓力的增加，這些脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域合并成更大的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在高表面壓力下，Ca2+對(duì)兩性離子脂質(zhì)和陰離子脂質(zhì)單層都產(chǎn)生“縮合效應(yīng)”，表明離子優(yōu)先與脂質(zhì)頭基中的磷酸部分相互作用。在VSFG和表面張力測(cè)量中，Ca2+與脂質(zhì)結(jié)合的分子特征從水和Ca溶液上的單分子膜之間的信號(hào)變化中可以明顯看出，對(duì)應(yīng)于4?2/脂的面積變化，精確地說(shuō)是Ca2+離子的表面積。

確認(rèn)

這項(xiàng)工作是“材料粘貼voor Fundamenteel Onderzoek（FOM）”研究項(xiàng)目的一部分，該項(xiàng)目由“荷蘭voor Wetenschapelijk Onderzoek（NWO）”組織資助。我們感謝本特·卡塞莫（BengtKasemo）建議進(jìn)行這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，并感謝克里斯蒂安·蒂舍爾（Christischer）和拉杰什·皮萊（RajeshPillai）對(duì)熒光顯微鏡的幫助。

可用支持信息：實(shí)驗(yàn)部分，DMPS單分子膜的VSFG光譜，以及使用和頻生成的分子取向分析。此材料可通過(guò)以下網(wǎng)址免費(fèi)獲?。篽ttp://pubs.acs.org.