摘要

底物特異性是表征酶的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，它直接關(guān)系到酶的應(yīng)用潛力。商品化的Lecitase Ultra已被廣泛用于石油脫膠過(guò)程中，以特異性水解原油中的磷脂，但其對(duì)各種磷脂的特異性仍不清楚。在本研究中，采用單層技術(shù)，在不同的表面壓力條件下表征了超乳糖酸酶對(duì)不同種類磷脂的選擇性。超乳糖酸酶對(duì)各種磷脂的水解活性高度依賴于單層膜的表面壓力。在相同的表面壓力（25mN/m）下，在所有磷脂單層膜的液體冷凝狀態(tài)下，超卵磷脂酶對(duì)不同單分子磷脂膜的偏好順序?yàn)镻E>CL>PS>PI>PC。在測(cè)試的表面壓力范圍內(nèi)，未觀察到鞘磷脂的水解活性。目前的研究提供了關(guān)于Lecitase Ultra對(duì)各種磷脂的選擇性偏好順序的基本信息，這是以前未知的，并為更好地利用這種酶在石油工業(yè)中提供了額外的信息。

實(shí)際應(yīng)用

據(jù)我們所知，我們已經(jīng)報(bào)道了應(yīng)用單層技術(shù)研究超乳糖酸酶對(duì)各種天然磷脂的底物選擇性。這項(xiàng)研究直接有助于該酶在工業(yè)中的應(yīng)用。此外，我們?cè)噲D證明單層技術(shù)對(duì)于評(píng)估某些天然底物的酶活性是非常有效和簡(jiǎn)單的，并且應(yīng)該在界面酶工程領(lǐng)域做出更大的貢獻(xiàn)。

圖形摘要

利用單層技術(shù)表征超乳糖酸酶對(duì)不同磷脂的界面催化性能。

1、介紹

Lecitase Ultra是藍(lán)綠假單胞菌脂肪酶（TLL）和尖孢鐮刀菌脂肪酶（FOL）的嵌合體[1]，具有相當(dāng)高的磷脂酶活性和脂肪酶活性[2]。這種酶完全基于其磷脂酶活性，能夠水解油中的磷脂，并通過(guò)形成溶血磷脂和甘油磷脂將其去除，從而成功地用于植物油的脫膠[3,4]。正如我們所知，不同來(lái)源的原油中磷脂的組成和含量存在顯著差異：例如，原油中的卵磷脂通常含有20%的磷脂酰膽堿（PC）、15%的磷脂酰乙醇胺（PE）、20%的磷脂酰肌醇（PI）、5%的磷脂酸（PA）和其他磷脂[5]。因此，Lecitase Ultra對(duì)不同磷脂的選擇性是實(shí)際應(yīng)用中的一個(gè)重要參考指標(biāo)，這反過(guò)來(lái)又與應(yīng)添加的酶量以及脫膠過(guò)程中所需的反應(yīng)時(shí)間直接相關(guān)。因此，獲得這種酶對(duì)天然磷脂的選擇性信息尤為重要。然而，仍然缺乏對(duì)這方面的深入了解。

脂肪酶作為一種界面酶，催化不溶性底物與水之間的界面水解反應(yīng)[6]。因此，脂肪分解的催化反應(yīng)與各種界面現(xiàn)象有關(guān)，并強(qiáng)烈依賴于界面上存在的脂質(zhì)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)組織[6-8]。為了獲得有關(guān)酶對(duì)各種磷脂選擇性的適當(dāng)信息，選擇合適的測(cè)試方法至關(guān)重要，應(yīng)該是首要考慮的問(wèn)題。

單層技術(shù)是研究空氣/水界面上酶-脂質(zhì)相互作用的最通用的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，已被用于通過(guò)相對(duì)表面活性來(lái)比較脂肪酶的底物選擇性[9]。使用單層技術(shù)進(jìn)行酶表征有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，底物和酶只需要少量的物質(zhì)。因此，我們可以以非常低的成本獲得酶的活性信息。其次，可以改變表面組分的分子堆積，并且可以連續(xù)監(jiān)測(cè)脂質(zhì)或蛋白質(zhì)從界面的釋放或轉(zhuǎn)移到界面的情況。第三，與傳統(tǒng)的pH-stat方法相比，該方法的高靈敏度已通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證[10,11]。最后，反應(yīng)的物理化學(xué)參數(shù)，如溫度、側(cè)壓、分子密度、離子條件等，可以在很寬的范圍內(nèi)方便地改變，并且可以以?精度分析結(jié)構(gòu)[12]。因此，單分子層是研究界面酶反應(yīng)的合適模型。到目前為止，不同種類的脂肪酶，甚至磷脂酶（包括磷脂酶A2、C和D）已經(jīng)通過(guò)使用這種方法進(jìn)行了表征[11-14]。

本文首次采用單層技術(shù)對(duì)商品化超乳糖酸酶的底物選擇性進(jìn)行了表征。目前的結(jié)果不僅提供了對(duì)酶底物選擇性的透徹理解，而且為酶在石油工業(yè)中的具體用途提供了詳細(xì)信息。

2、材料和方法

2.1材料

商業(yè)Lecitase Ultra由丹麥巴格斯瓦爾德諾維信A/S提供，直接測(cè)試，無(wú)需進(jìn)一步純化。L-α-磷脂酰肌醇（PI，純度≥1,2-二?；?sn-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸（PS，純度≥97%），L-α-磷脂酰乙醇胺（PE，純度≥1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PC，純度≥97%），心磷脂（CL，純度）≥鞘磷脂（SM，純度）≥98%）和β-環(huán)糊精從Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）購(gòu)買。HPLC級(jí)氯仿購(gòu)自凱美爾化學(xué)試劑有限公司（天津）。使用Millipore（馬薩諸塞州貝德福德）Milli-Q水系統(tǒng)凈化水。所有其他攝政王都是分析級(jí)的。

2.2單分子薄膜實(shí)驗(yàn)

2.2.1表面壓力-面積等溫線

使用帶有Langmuir-Teflon槽（206 mm×59 mm）的商用單層系統(tǒng)（芬蘭赫爾辛基Kibron的微槽X）和兩個(gè)屏障的對(duì)稱壓縮，記錄不同磷脂單層的壓縮等溫線。實(shí)驗(yàn)在室溫（25℃）下進(jìn)行。通過(guò)使用microsyringe（Hamilton Co.，Reno，NV）將不同磷脂的氯仿儲(chǔ)備溶液滴在50 mM檸檬酸緩沖液（pH 5.0）亞相上形成單層（Hamilton Co.，Reno，NV）。15分鐘后，以2.5 mm/min的速率連續(xù)壓縮所需組合物的單層。表面壓力是用附著在表面的金屬絲探針測(cè)量的。連續(xù)記錄表面壓力與表面積（π-A）等溫線。只要需要，膠片就被壓縮到崩潰壓力。每次運(yùn)行重復(fù)三次，保持π-A等溫線的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4?2。

2.2.2使用一個(gè)"零級(jí)"槽（由一個(gè)圓形反應(yīng)室和兩個(gè)儲(chǔ)液室（182mm×40mm）組成）進(jìn)行了Lecitase Ultra的動(dòng)力學(xué)水解活性計(jì)算。反應(yīng)室的直徑為21 mm，面積為346 mm2。這兩種隔室通過(guò)一個(gè)小的表面通道（寬0.5厘米）相互連接。該方法的原理之前由Verger和De Haas[15]描述。在目前的工作中，用毫Q水制備50 mM檸檬酸緩沖液（pH 5.0），并通過(guò)0.45μm微孔膜過(guò)濾。在50 mM檸檬酸緩沖液（pH 5.0）亞相上涂抹幾微升氯仿磷脂溶液，直到達(dá)到所需的初始表面壓力（πi），制備單層。由恒壓器自動(dòng)驅(qū)動(dòng)的移動(dòng)式屏障在儲(chǔ)層上來(lái)回移動(dòng)，以壓縮并保持表面壓力（π）恒定。為了確保水解反應(yīng)中產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈脂肪酸能夠溶解在水中，按照Mosbah等人的建議，將β-環(huán)糊精（0.6 mg/ml）注入反應(yīng)室。[10]。然后將10μL酶溶液注入反應(yīng)室的亞相以開(kāi)始反應(yīng)。如前所述，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了相應(yīng)的分析[15,16]。活性顯示為單位時(shí)間、單位反應(yīng)室面積和"零級(jí)"槽中每毫升酶水解的底物摩爾數(shù)（摩爾數(shù)cm-2.min-1.mL-1）。所有分析測(cè)定均一式三份進(jìn)行。結(jié)果以平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）的形式清楚地呈現(xiàn)。