欧美群交射精内射颜射潮喷_国产精品igao视频_欧美变态口味重另类在线视频_亚洲最大av网站在线观看_国产亚洲精品久久久久秋

芬蘭Kibron專(zhuān)注表面張力儀測(cè)量技術(shù),快速精準(zhǔn)測(cè)量動(dòng)靜態(tài)表面張力

熱線:021-66110810,56056830,66110819,66110690,13564362870 Email: info@vizai.cn

合作客戶/

拜耳公司.jpg

拜耳公司

同濟(jì)大學(xué)

同濟(jì)大學(xué)

聯(lián)合大學(xué).jpg

聯(lián)合大學(xué)

寶潔公司

美國(guó)保潔

強(qiáng)生=

美國(guó)強(qiáng)生

瑞士羅氏

瑞士羅氏

當(dāng)前位置首頁(yè) > 新聞中心

應(yīng)用不同組裝的磷脂酰膽堿對(duì)牛精漿蛋白的隔離:一種新的技術(shù)方法——摘要、介紹、材料和方法

來(lái)源:上海謂載 瀏覽 1207 次 發(fā)布時(shí)間:2022-01-19

摘要


精子結(jié)合蛋白(BSP)是牛精漿中的主要蛋白質(zhì),已知其部分插入精子膜的外小葉,并與其中存在的含膽堿脂質(zhì)結(jié)合。這種插入通過(guò)誘導(dǎo)精子早期獲能,對(duì)冷凍保存后的精液質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。BSP蛋白表面性質(zhì)的假設(shè)通過(guò)張力測(cè)定法進(jìn)行了驗(yàn)證:BSP蛋白具有高度的表面活性。這表明BSP蛋白不僅通過(guò)相互之間的相互作用,而且由于其自身的表面活性,能夠到達(dá)磷脂覆蓋的界面。BSP蛋白插入精子外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域是在類(lèi)似Langmuir單分子膜的仿生系統(tǒng)上復(fù)制的。BSP蛋白的插入可以在含有膽堿脂質(zhì)的可壓縮流體域中進(jìn)行。單層膜也被用來(lái)研究BSP蛋白與兩種磷脂組裝物的絡(luò)合作用:蛋黃低密度脂蛋白(LDL)或雞蛋磷脂脂質(zhì)體。無(wú)論磷脂結(jié)構(gòu)(脂蛋白或脂質(zhì)體)如何,BSP都不能改變膜的結(jié)構(gòu)。只有BSP蛋白與磷脂酰膽堿的總比例是重要的。這兩種螯合劑的區(qū)別在于它們的表面性質(zhì):LDL有很強(qiáng)的與外層結(jié)合的傾向,而脂質(zhì)體主要以相同的時(shí)間尺度保持在本體中。


1、介紹


精子結(jié)合蛋白(BSP)是一個(gè)已知在輸卵管精子儲(chǔ)存庫(kù)的形成和精子獲能中起作用的蛋白質(zhì)家族,精子成熟是受精的關(guān)鍵步驟[1,2]。在牛精漿中,根據(jù)Manjunath等人的命名法[2]:BSP1[4]、BSP3[5]和BSP5[6,7]分別鑒定和分類(lèi)了三種比例為10:1:1的主要BSP蛋白[3]。BSP1和BSP3的表觀質(zhì)量為15–16.5 kDa,BSP5的表觀質(zhì)量為28–30 kDa[6,8]。這三種蛋白質(zhì)由一個(gè)獨(dú)特的N端結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)纖維連接蛋白II型結(jié)構(gòu)域組成。只有三種BSP蛋白的N端結(jié)構(gòu)域存在顯著差異[4–6]。每個(gè)纖維連接蛋白II型結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)磷酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)[9–14]。最后這些是BSP蛋白的生物學(xué)作用所必需的。事實(shí)上,精子膜的外小葉在射精過(guò)程中與含有BSP蛋白的精漿接觸[2,15]。BSP蛋白與精子膜上的含膽堿磷脂(如磷脂酰膽堿和鞘磷脂)快速結(jié)合[9,12,16–19],并通過(guò)部分插入精子質(zhì)膜的外小葉[1,13,20]覆蓋精子表面。這是通向輸卵管精子儲(chǔ)存庫(kù)和精子獲能的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。BSP蛋白既可溶又能插入疏水膜的事實(shí)證明BSP蛋白具有兩親性。因此,本研究的第一部分旨在通過(guò)進(jìn)行張力測(cè)量來(lái)檢驗(yàn)這一假設(shè)。


BSP蛋白誘導(dǎo)的早期獲能[21,22]對(duì)冷凍保存后的精液質(zhì)量有負(fù)面影響,因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致抗冷性和抗凍性的喪失[12,17,23–25]。因此,保護(hù)器的存在對(duì)維持精子質(zhì)量至關(guān)重要。蛋黃被廣泛用于分離BSP蛋白[17,26–32]。這種隔離是由于蛋黃中存在的低密度脂蛋白(LDL)外層的磷脂酰膽堿與BSP蛋白之間的特異性和強(qiáng)相互作用[9,12,33,34]。在某些情況下,還假設(shè)低密度脂蛋白對(duì)精子早期獲能的保護(hù)作用是由于富含磷脂的低密度脂蛋白極性脂質(zhì)與由于外排而減少的脂質(zhì)和膽固醇的精子膜之間的交換[29]。目前,大豆卵磷脂等其他磷脂被用作蛋黃磷脂的替代品。然而,在這種情況下,脂質(zhì)體和膜之間可能的相互作用尚不清楚。因此,本研究的第二部分旨在比較低密度脂蛋白和脂質(zhì)體與脂膜接觸的行為。為此,在空氣-緩沖液界面上的脂質(zhì)單層被用來(lái)模擬精子膜外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這種方法被證明能有效地復(fù)制牛精子膜外小葉脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的異質(zhì)結(jié)構(gòu)域[35]。最后一種是主要的脂質(zhì)成分,即鞘磷脂、膽固醇、1-棕櫚酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(PC)和血漿鹵素1-(1Z-十八烯基)-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(P-PC)。在這一單層中,膽固醇和鞘磷脂在34°C處由PC和P-PC的液體混合物包圍,形成凝聚結(jié)構(gòu)域?C.LDL和脂質(zhì)體在接近生物膜相關(guān)壓力的情況下被引入單層下方的亞相[36]。通過(guò)監(jiān)測(cè)表面積的變化來(lái)檢測(cè)添加劑與單層膜之間的相互作用。最后,在相同的精子膜外小葉脂質(zhì)模型和相同的條件下,比較了LDL和脂質(zhì)體對(duì)BSP蛋白的隔離特性。


2、材料和方法


2.1.材料


主要構(gòu)成重構(gòu)膜外小葉的脂質(zhì)購(gòu)自Avanti Polar Lipides(美國(guó)阿拉伯斯特市阿拉伯斯特市),并按接收時(shí)使用?;衔?-棕櫚酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(PC(16:0/22:6),分子量=806.1,純度>99%)和1-(1Z-十八烷基)-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿PC(P-18:0/22:6,分子量=818.2,純度>99%)作為氯仿溶液(10mg-mL)獲得?1).將PC(16:0/22:6)和P-PC(18:0/22:6)的儲(chǔ)備溶液稀釋至1.25 mg mL?1解決方案。以綿羊毛膽固醇(Chol,Mw=711.0,純度>98%)和雞蛋鞘磷脂(SM,Mw=386.7,純度>98%)為粉末。二者均以1.25 mg/mL的濃度溶解于氯仿(HPLC級(jí),法國(guó)瓦爾德魯伊爾Carlo Erba)?1.


低溫保護(hù)培養(yǎng)基由Trizma堿(173.0 mM)、一水合檸檬酸(70.0 mM)、果糖(56.0 mM)、甘油(6.4%;v/v)和抗生素(青霉素G鈉391 mg L)組成?1,硫酸鏈霉素856 mg L?1,鹽酸林可霉素204 mg L?1,硫酸大觀霉素四水合物585 mg L?1)(西格瑪-奧爾德里奇,法國(guó)圣昆廷法拉維爾)。將pH值調(diào)整為6.2,其滲透壓約為1300.0 mOsm。


2.2.低密度脂蛋白的提取


根據(jù)Moussa等人的方案,從蛋黃中提取低密度脂蛋白(LDL)[31]。提取后,將低密度脂蛋白濃縮提取物(22±0.5 g,相當(dāng)于8.36 g干低密度脂蛋白)在低溫保護(hù)介質(zhì)(100 mL)中稀釋。通過(guò)micro BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce,Thermoscitific,F(xiàn)rance)對(duì)LDL樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,得出8.9±1.0 mg-mL?1.LDL樣品中PC磷脂的含量是根據(jù)雞蛋中PC的自然比例(18.4 g PC/100 g干LDL)計(jì)算得出的,Givenbyonton等人[33]。它等于15.4克升?1份低密度脂蛋白樣品。LDL也含有一小部分PE(PC/PE 6:1)[33]。


2.3.精漿收集


從一頭Prim Holstein公牛身上收集牛精子,并立即以10000×g離心兩次,以回收上清液中的精漿。我們樣品的蛋白質(zhì)含量為88.5±5.0mg-mL?1,由micro BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce,Thermoscitific,法國(guó))測(cè)定。


2.4.脂質(zhì)體的制備


脂質(zhì)體由冷凍保護(hù)緩沖液中的卵磷脂提取物通過(guò)使用Avanti Polar Lipides(美國(guó)阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州)的微型擠出機(jī)擠出而制備。卵磷脂提取物由磷脂酰膽堿(73%)和磷脂酰乙醇胺(11%)以及甘油三酯和鞘磷脂等次要成分組成。提取物在低溫保護(hù)緩沖液中水合過(guò)夜,脂質(zhì)濃度分別為3.90 mg-mL?1(C1),7.28毫克/毫升?1(C2),14.56毫克/毫升?1(C3)和21.84毫克/毫升?1(C4)。然后在超聲波浴中對(duì)分散液進(jìn)行15分鐘的超聲波處理(Elmasonic S 30H,來(lái)自德國(guó)Singen Elma,功率為275W)。最后,在擠出機(jī)中擠出分散體(20次穿過(guò)100 nm的膜)。分布尺寸集中在120nm,Zeta電位值為?6毫伏。在BSP存在下引入的脂質(zhì)體量以重量表示(脂質(zhì)體分散體C1、C2、C3和C4分別為1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和6.55 mg的脂質(zhì))。不確定度為0.01 mg。


2.5.電泳


十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在還原條件下進(jìn)行。將精漿溶解在pH值為6.8的緩沖液中,該緩沖液由Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和溴酚藍(lán)0.4%組成,以獲得1mg mL?1解決方案。添加9%巰基乙醇v/v,并旋轉(zhuǎn)樣品,隨后在95℃下加熱?C 5分鐘。然后,將10?L低范圍分子量標(biāo)準(zhǔn)品(法國(guó)Souffelweyersheim Euromedex公司的試劑盒O6U-0511)和10至25?L精漿裝入15%聚丙烯酰胺凝膠(pH 6.8-Tris 0.5 M和SDS 0.10%)中,并與由Tris 0.025 M、甘氨酸0.192 M和SDS 0.1%組成的pH 8.3遷移緩沖液耦合。在20 mA時(shí)進(jìn)行電泳,并用考馬斯藍(lán)溶液G250對(duì)凝膠進(jìn)行染色。最后對(duì)染色凝膠進(jìn)行掃描,并使用Multi-Gauge軟件(2.0版,日本富士照片膠片有限公司)評(píng)估峰值強(qiáng)度。


2.6.表面活性測(cè)量


吉布斯膜(由精漿溶液擴(kuò)散到空氣-緩沖界面形成)的表面張力在安裝在朗繆爾天平(Microtoul XL-LB,Kibron Inc.,Helsinki,芬蘭)上的15孔板(帶特氟隆邊緣的鋁底多孔板)上測(cè)量,該天平配有高靈敏度傳感器(使用合金絲的Wilhelmy方法)。該裝置被放置在一個(gè)溫度控制區(qū),固定在23°C?C,并用純蒸餾水(美國(guó)密理博公司Milli-Q系統(tǒng))校準(zhǔn)。測(cè)量精度為0.1 mN/m。將精漿放入第一個(gè)孔中,然后在下一個(gè)孔中用因子2稀釋?zhuān)来祟?lèi)推(每個(gè)孔的體積為300?L)。每種精漿提取物重復(fù)測(cè)量4次(n=2)。結(jié)果表示為所有測(cè)量的平均值。


蛋白質(zhì)膜的壓縮等溫線是在之前配備傳感器的朗繆爾槽(MicroTour XL-LB,Kibron Inc.,芬蘭赫爾辛基)上測(cè)量的。精漿首先在冷凍保存緩沖液(1/100)中稀釋?zhuān)⒃诰彌_液表面逐滴(50?L)擴(kuò)散。平衡20分鐘后,在室溫下(23℃)記錄壓縮等溫線?C)。


2.7.精子膜外小葉脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的重建


精子膜外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域如前所述重建[35]。朗格繆爾槽(302LL,NIMA技術(shù),英國(guó))被插入一個(gè)自制的手套箱上,放置在抗振動(dòng)臺(tái)上,用氬氣沖洗,以避免脂質(zhì)氧化。表面壓力的測(cè)量精度為0.1 mN/m,使用濾紙制成的一塊極板(英國(guó)肯特郡邁德斯通惠特曼國(guó)際有限公司生產(chǎn)的無(wú)灰惠特曼色譜紙)與電子天平相連。環(huán)境溫度固定在20℃?C.將所有燒瓶和注射器放入手套箱中,然后在攤鋪單層之前用氬氣將手套箱脫氣1小時(shí)。朗繆爾天平的溫度由設(shè)置為40℃的循環(huán)水系統(tǒng)進(jìn)行恒溫控制?C.緩沖液表面的實(shí)際溫度為34℃?C.亞相由低溫保護(hù)介質(zhì)組成。以適當(dāng)?shù)哪柋龋?1:14:16:39)將膽固醇、鞘磷脂、P-PC(18:0/22:6)和PC(16:0/22:6)的氯仿溶液用25?L微型注射器(精確到0.5?L)逐滴地分散到緩沖液亞相上(Hamilton Bonaduz AG,Bonaduz,Switzterland)。單層保持平衡10分鐘,然后以40 cm2/min的屏障速度開(kāi)始?jí)嚎s。一旦達(dá)到目標(biāo)壓力(25 mN/m),通過(guò)調(diào)整可移動(dòng)屏障的表面積保持壓力恒定。由于單分子層在30 mN/m時(shí)不夠穩(wěn)定,這是與雙層中脂質(zhì)堆積密度相關(guān)的膜壓力[36],我們將目標(biāo)壓力降低到25 mN/m,其中單分子層更穩(wěn)定(見(jiàn)結(jié)果)。


一旦達(dá)到目標(biāo)壓力(25 mN/m),將其保持1000 s,然后使用彎曲針管將生物分子(LDL、BSP或脂質(zhì)體)溶液引入亞相。針頭彎曲遠(yuǎn)離針尖,并位于槽的底部,以便在壓縮的亞相下方進(jìn)行注射。之前將當(dāng)量體積(每種添加劑0.3 mL)移到屏障后面。注射生物分子后,監(jiān)測(cè)每個(gè)脂質(zhì)分子的面積變化,并表示為相對(duì)于初始值的變化(a/a=(a?A(t0)×100/A(t0)。它已經(jīng)被跟蹤了3000秒,相當(dāng)于冷凍保存前處理精液的時(shí)間。在這種恒壓模式下,生物分子插入脂質(zhì)單層導(dǎo)致膜壓力增加,而膜壓力通過(guò)增加表面積而降低。相反,如果生物分子導(dǎo)致脂質(zhì)單層溶解在亞相中,表面積就會(huì)減小。重復(fù)所有數(shù)據(jù),偏差不超過(guò)表面積的5%。


2.8.低溫透射電子顯微鏡(Cryo TEM)


使用低溫插入式低溫固定裝置(美國(guó)加坦)制備用于低溫TEM觀察的試樣,其中一滴水懸浮液沉積在輝光放電多孔型碳涂層格柵(美國(guó)Ted Pella公司)上。然后,通過(guò)將含有試樣的液滴吸干到支撐碳膜孔上殘留的薄層液體上,制備TEM網(wǎng)格。通過(guò)將格柵快速插入液氮冷卻的液態(tài)乙烷中,使液膜玻璃化。玻璃化標(biāo)本安裝在Gatan 910標(biāo)本架(美國(guó)Gatan)中,使用CT-3500-cryotransfer系統(tǒng)(美國(guó)Gatan)將其插入顯微鏡中,并用液氮冷卻。然后從保存在玻璃質(zhì)冰中并懸浮在支撐碳基質(zhì)上的孔中的標(biāo)本獲得TEM圖像。


在低劑量條件下觀察樣品(<10 e?/A2),在?178?C、使用JEM 1230“Cryo”顯微鏡(日本Jeol),在80 kV電壓下運(yùn)行,并配備LaB6燈絲。所有顯微照片均記錄在Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相機(jī)上。為確保觀察的良好重復(fù)性,從幾個(gè)樣品制備中采集了一系列超過(guò)50張的圖像,放大率不同。