Bestrophin-1(hBest1)是一種跨膜蛋白，在視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的基底外側(cè)膜上表達(dá)。hBest1的主要功能之一是氯離子的鈣依賴性運(yùn)輸。它還被認(rèn)為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮通道作用，參與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中γ-氨基丁酸(GABA)和星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中谷氨酸(Glu)的轉(zhuǎn)運(yùn)。BEST1基因的突變（表現(xiàn)在合成的蛋白質(zhì)中）是導(dǎo)致視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的原因，稱(chēng)為Bestrophinopathies。關(guān)于hBest1與不同細(xì)胞膜脂質(zhì)的分子相互作用的科學(xué)數(shù)據(jù)不足以闡明蛋白質(zhì)的功能活性，尤其是與膽固醇(Chol)，它在“經(jīng)典”脂筏的形成中起關(guān)鍵作用。膽固醇的主要物理化學(xué)性質(zhì)之一是其凝聚作用。Chol與卵磷脂的相互作用導(dǎo)致脂肪酸烴殘基的構(gòu)象變化和“干擾”減少，它們的方向轉(zhuǎn)向分子的中心軸，自由體積和橫截面減少，以及在不改變表面壓力的情況下被分子占據(jù)的區(qū)域。當(dāng)與某些類(lèi)型的多不飽和磷脂相互作用時(shí)，膽固醇沒(méi)有凝聚作用。

在這項(xiàng)研究中，特別關(guān)注Chol與hBest1在純和復(fù)合蛋白質(zhì)-脂質(zhì)模型系統(tǒng)中的相互作用。使用朗繆爾單層膜進(jìn)行表面壓力測(cè)量和布魯斯特角顯微鏡成像，我們證明了Chol對(duì)純hBest1單層膜的凝聚效應(yīng)可以忽略不計(jì)，在Ca 2+離子存在下會(huì)變得更高。

Kibron膜分析儀的的應(yīng)用

PTFE涂層的不銹鋼多孔板（孔容量0.5 mL）和Wilhelmy測(cè)力探頭的Langmuir天平（Kibron Inc）在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，溫度為35±2°C。單層在含有150 mM NaCl(pH~7)的亞相上形成，添加和不添加0.5μM CaCl 2。將單層的成分連續(xù)應(yīng)用于界面.首先將POPC或雞蛋SM（氯仿中的1 mM儲(chǔ)備溶液）涂抹至表面壓力π達(dá)到20 mN/m，然后添加Chol（氯仿中的0.1 mM儲(chǔ)備溶液）2分鐘后，摩爾分?jǐn)?shù)X Chol0.167 0.285、0.375、0.444或0.5。再過(guò)2分鐘后，當(dāng)溶劑蒸發(fā)且π達(dá)到恒定值時(shí)，將hBest1（在150 mM NaCl中的1 mg/mL儲(chǔ)備溶液）添加到二元POPC/Chol或SM/Chol單分子層中。擴(kuò)散hBest1的體積是相對(duì)于系統(tǒng)中的主要脂質(zhì)（POPC或SM）計(jì)算的，摩爾比分別為1:45和1:86，因此蛋白質(zhì)所占的面積與周?chē)|(zhì)所占的面積為1:3。在將hBest1應(yīng)用到界面上10分鐘后進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行七次.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單分子層膜中膽固醇的濃度會(huì)影響膜蛋白的許多物理化學(xué)、生化和生物物理特性。對(duì)于Na+K+ATPase——Chol濃度顯示出調(diào)節(jié)作用——在膜中低至中等水平的膽固醇（膽固醇：磷脂的比例從1:4到1:2）時(shí)，活性增加，而在較高水平膽固醇濃度（膽固醇：磷脂比，1:1）酶活性降低。視紫紅質(zhì)的功能還取決于膽固醇的存在。高濃度的膽固醇導(dǎo)致層增厚和視紫紅質(zhì)無(wú)法改變其構(gòu)象，這是其功能所必需的。研究結(jié)果證明了膽固醇對(duì)hBest1和復(fù)合hBest1薄膜的凝聚作用。在POPC/Chol/hBest1和SM/Chol/hBest1三元單分子層中，冷凝效應(yīng)發(fā)生在不同膽固醇濃度下。這也表明Ca 2+離子在膽固醇凝聚效應(yīng)中起關(guān)鍵作用——對(duì)于hBest1/Chol和hBest1/SM/Chol單分子層非常明顯。

圖1.膽固醇對(duì)(A)hBest1、(B)hBest1/POPC、(C)hBest1/SM、(D)POPC和(E)SM單分子層的凝聚效應(yīng)（Chol的摩爾分?jǐn)?shù)為0.167；0.285；0.375；0.444和0.5)在存在或不存在Ca 2+的情況下，在35±2°C。數(shù)據(jù)表示為平均值±SE，n=7。

圖2.(A)hBest1/Chol單分子層、(B)hBest1/POPC/Chol(C)hBest1/SM/Chol單分子層的BAM圖像（摩爾分?jǐn)?shù)為Chol 0.167；0.285；0.375；0.444和0.5）Ca 2+的存在與否，在35±2°C。白色比例尺=100μm。

圖3、(A)POPC/Chol單層膜，(B)SM/Chol單層膜的BAM圖像(Chol摩爾比為0.167;0.285;0.375;0.444和0.5)，存在或不存在Ca2+，在35±2°C。白色比例尺=100?m。

總結(jié)

bestrophin-1蛋白(hBest1)是一種跨膜通道，與視網(wǎng)膜色素上皮中氯離子的鈣依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)以及神經(jīng)細(xì)胞中谷氨酸和GABA的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。hBest1、鞘磷脂、磷脂酰膽堿和膽固醇之間的相互作用對(duì)于hBest1與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)域及其生物學(xué)功能的關(guān)聯(lián)至關(guān)重要。由于膽固醇在脂筏的形成、脂質(zhì)的運(yùn)動(dòng)排序和側(cè)膜結(jié)構(gòu)的建模/重塑中起關(guān)鍵作用，研究人員應(yīng)用LB單分子層膜技術(shù)（Kibron膜分析儀）檢查了不同膽固醇濃度對(duì)hBest1/POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)和hBest1/SM Langmuir單分子層在存在/不存在Ca 2+的情況下離子使用表面壓力測(cè)量和布魯斯特角顯微鏡研究。研究人員使用朗繆爾單層膜（Kibron）進(jìn)行表面壓力測(cè)量和布魯斯特角顯微鏡成像，研究證明了Chol對(duì)純hBest1單層膜的凝聚效應(yīng)可以忽略不計(jì)，在Ca 2+離子存在下會(huì)變得更高。在不存在Ca 2+的情況下，Chol對(duì)復(fù)合hBest1/POPC和hBest1/SM單分子層也表現(xiàn)出顯著的凝聚效應(yīng)，在添加Ca 2+離子后會(huì)有所不同。研究結(jié)果揭示了表面單層平面中hBest1分子的組織和結(jié)構(gòu)構(gòu)象的Chol作用，以了解蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)域的關(guān)聯(lián)，這一過(guò)程可能會(huì)影響其生物學(xué)功能。